在第一步中,将六个金门入口向量合并为目标向量。有各种可以使用的金门目标向量,其中包含可以使用的不同植物和/或视觉标记物(请参阅补充数据集1中的金门目标矢量(CCDB +)1)。第一个入口向量(AB)包含组织特异性表达的启动子。第三个入口矢量(CD)包含核酸酶,可以与N末端(BC)或C末端标签(DE)结合使用。另外,如果不需要标签,则使用链接序列。第五入口矢量(EF)包含工厂终结器。选择的第六个黄金入口向量(FG)取决于最终目标。要克隆与一个或两个GRNA兼容的矢量,请使用未武装的GRNA进入矢量PGG-F-F-ATU6-26-AARI-AARI-AARI-G(请参阅补充数据集1中的未武装GRNA进入向量1)。要克隆与多个GRNA兼容的矢量,请使用可变的链接器PGG-F-a-aari-sacb-aari-g-g(请参阅补充数据集1中的可变链接器)。由于我们的克隆策略使用限制酶Bsai和Aari,因此要求所有向量都需要无BSAI和AARI-FIME(除了克隆位点)。
主要关键词