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World File Search SystemHEK293T
工程自动核解哺乳动物悬架宿主细胞系，以降低无血清慢病毒过程流中的DNA杂质水平
摘要：我们用转基因编码四环素诱导的金黄色葡萄球菌核酸酶，并结合了易位信号。我们调整了未修饰和核酸酶工程的细胞系在无血清培养基中的悬浮液中生长，分别产生HEK293TS和NUPRO-2S细胞系。瞬时转染产生的1.19×10 6慢病毒转染来自Nupro-2S细胞的每毫升（TU/mL），HEK293TS细胞的1.45×10 6 Tu/ml。DNA梯子消失揭示了以四环素诱导的方式由NUPRO-2S细胞引起的中等居民核酸酶活性。DNA杂质水平在NUPRO-2S和HEK293TS细胞引起的慢病毒材料中无法通过SYBR安全琼脂糖凝胶染色检测到。通过PICOGREEN试剂进行直接测量表明，在HEK293TS细胞的慢病毒材料中，DNA以636 ng/ml的形式存在，在Nupro-2S细胞的慢病毒材料中，杂质水平降低了89％至70 ng/ml。通过使用50个单位/mL苯并酶处理HEK293TS衍生的慢病毒材料，这种还原与23 ng/ml相当。关键词：慢病毒，哺乳动物细胞，生物普应，基因治疗，核酸酶
辐射，DNA损伤和RPA1中度过表达的细胞中的DNA修复
分子对遗传毒性应激的反应，例如电离辐射，复杂复杂，涉及数百个基因。靶向内源基因是否可以增强对电离辐射的阻力仍有待探索。在本研究中，我们利用CRISPR/DCAS9技术的优势中度过表达RPA1基因，该基因编码了复制蛋白A（RPA）的关键功能亚基。RPA是一种高度保守的异三个单链DNA结合蛋白复合物，参与了DNA复制，重组和修复。RPA1的功能障碍对细胞和生物有害，并且可能导致对许多应激因素的抗药性降低。我们证明，过表达RPA1的HEK293T细胞通过伽马辐射对细胞杀死的抗性增强。使用碱彗星测定法，我们显示出在RPA1过表达细胞中γ辐照后，DNA断裂的显着加速。然而，在RPA1过表达的情况下，DNA损伤的自发速率也更高，这表明由于RPA蛋白的活性升高而导致复制误差的处理改变。此外，对具有不同水平DNA损伤的细胞分布的分析显示了RPA1过表达与DNA修复动力学之间的联系，在差异损坏的细胞亚群中。我们的结果提供了有关DNA损伤应力反应的知识知识，并表明通过靶向改变单个基因表达来增强放射线的概念是可行的，但是应考虑和评估不希望的后果。
文章抑制 SHROOM1 可通过促进同源定向修复来改善体内和体外基因整合
摘要：同源重组 (HR) 常用于实现靶向基因整合，因为与微同源介导的末端连接 (MMEJ) 或非同源末端连接 (NHEJ) 相比，它具有更高的精度和可操作性。由于它只在细胞分裂期间发生，因此似乎对动物细胞和胚胎中的基因整合效率较低。在这里，我们开发了全基因组高通量筛选和随后的配对 crRNA 文库筛选，以寻找抑制同源定向修复 (HDR) 的基因。我们发现，在报告系统中，敲低 SHROOM1 的 HDR 细胞比对照细胞富集多达 4.7 倍。无论供体类型如何，下调 SHROOM1 均可显著促进人类和小鼠细胞中成簇的规律间隔短回文重复序列 (CRISPR)/CRISPR 相关蛋白 9 核酸酶 (Cas9) 切割后的基因整合。通过在微注射过程中应用 SHROOM1 siRNA，小鼠胚胎的敲入效率也可以加倍。HEK293T 细胞中 SHROOM1 缺失引起的 HDR 效率增加可被 HDR 抑制剂 YU238259 抵消，但不能被 NHEJ 抑制剂抵消。这些结果表明 SHROOM1 是一个 HDR 抑制基因，SHROOM1 敲低策略可能适用于多种应用，包括基因编辑以生成用于研究基因功能和人类疾病的细胞系和动物模型。
在两个日本兄弟姐妹中发现的一种新型的致病变异，这些葡萄糖酶基因具有年轻2
摘要。葡萄糖酶是一种糖酵解酶，可在糖酵解途径的第一步中催化葡萄糖磷酸化为葡萄糖-6-院子的磷酸化。它还通过催化葡萄糖的磷酸化来调节胰腺β细胞中胰岛素分泌的阈值，并作为葡萄糖传感器起重要作用。葡萄糖酶基因（GCK）中的致病变异引起非促进但持续的轻度禁食性高血糖，也被认为是年轻2的成熟 - 糖尿病（MODY2）。本报告介绍了两个日本兄弟姐妹的Mody2，他们最初被诊断出在20至17岁时被诊断出患有葡萄糖不耐症，后来患有糖尿病。他们没有肥胖史，对胰岛相关的自身抗体为阴性，其血清C肽水平在正常范围内。糖尿病并发症。下一代测序揭示了GCK中的一种新型杂合变体（NM_000162.5：c.1088a> g，p.asp363gly）。此变体以前尚未报道。在使用SIFT和MUTATIONTASTER的计算机功能分析中，表明该变体正在损害。确认突变GCK的功能影响，在HEK293T细胞中暂时表达了hibit标记的p.asp363gly变体和野生型GCK。与表达野生型GCK的细胞相比，表达变体GCK的细胞表现出79％的生物发光，这表明该变体的病理生理学是单倍弥补的结果。
CRISPR 转录激活因子的特定调节......
摘要 细胞转录本编码了有关细胞身份和疾病状态的重要信息。响应 RNA 生物标志物而激活 CRISPR 有可能以时空精度控制 13 CRISPR 活性。这将能够将 CRISPR 活性限制在表达目标 RNA 生物标志物的特定细胞类型，同时防止其他细胞中出现不必要的活性。在这里，我们提出了一个简单而具体的平台，用于通过工程化脓性链球菌 Cas9 单向导 RNA (sgRNA) 来调节响应 RNA 检测的 CRISPR 活性。sgRNA 被设计成折叠成复杂的二级结构，在基态下抑制其活性。识别互补 RNA 后，工程化的 sgRNA 19 被激活，使 Cas9 能够发挥其功能。我们的方法使 CRISPR 20 在 HEK293T 细胞和斑马鱼胚胎中响应 RNA 检测而激活。迭代 21 设计优化允许开发用于生成能够检测所选 RNA 序列的 sgRNA 22 的计算工具。机制研究表明，工程 23 sgRNA 在 RNA 检测过程中被切割，并且我们确定了受益于 24 化学修饰的关键位置，以提高工程 24 sgRNA 在体内的稳定性。我们的传感器为使用 26 CRISPR 激活来响应内源性 RNA 生物标志物开发新的研究和治疗应用开辟了新的机会。 27
针对 p53 R175H 突变表位的 DNA 递送单克隆抗体可抑制小鼠肿瘤发展
摘要 肿瘤抑制基因 p53 是癌症中最常见的突变基因，其中 R175H 是最常见的 p53 错义突变。然而，目前还没有针对突变 p53 的靶向疗法或免疫疗法获得批准。在这里，我们表征并研究了一种识别突变 p53-R175H 的单克隆抗体 (mAb)，以了解其亲和力、特异性和体外抗肿瘤细胞活性。然后，我们将表达抗 R175H mAb 或双特异性抗体 (BsAb) 的 DNA 质粒递送到小鼠体内，以评估其治疗效果。我们的结果表明，抗 R175H mAb 以高亲和力特异性结合 p53-R175H 抗原，并识别 HEK293T 或 MC38 细胞上表达的人类突变型 p53-R175H 抗原，与野生型 p53 无交叉反应。在培养细胞中，抗 R175H mAb 表现出比对照更高的细胞毒性，但不会诱导抗体依赖性细胞毒性。我们在敲除内源性突变型 p53 等位基因后，制作了重组 MC38 小鼠细胞系 (MC38-p53-R175H)，该细胞系过表达人类 p53-R175H。在体内，施用抗 R175H mAb 质粒对小鼠的 MC38-p53-R175H 产生了强大的抗肿瘤作用。抗 R175H BsAb 质粒的给药没有显示出治疗效果，但与抗 PD-1 抗体联合使用时观察到了强大的抗肿瘤活性。这些结果表明，针对特定突变表位使用
在哺乳动物细胞中细菌亮氨酸tRNA的定向进化，以增强非规范氨基酸诱变
图2。tRNA leu库设计和下一代测序选择数据。a）受体茎的序列对齐的WEBLOGO表示来自682个细菌trNA，表明每个位置在每个位置的每个残基相对丰度。编号方案相对于tRNA ecleu（面板b）。b）野生型大肠杆菌tRNA cuA leu的三叶草结构，通过随机使受体词干碱基对随机使图书馆生成方案。基础配对均通过根据框中显示的彩色方案在每个位置引入每个位置的成对替换来维护。随机化被限制以维持保守的序列元素（面板A）。c）在选择之后和之前，使用其在文库中的标准化丰度（以前/以前/丰度）在库中测量了库中每个突变体在库中的富集。进行了选择的两种生物学重复，并彼此绘制了这两种重复物中观察到的每个突变体的富集。d）显示了最高1％（最丰富）序列的共识序列。提供了WT-TRNA ecleu的序列作为参考。e）在存在或不存在1 mM帽的情况下，通过将每个tRNA ecleu突变体的活性与PLRS1和EGFP-39TAG一起转染中，与PLRS1和EGFP-39TAG进行了测试（另请参见图S5）。在无细胞提取物中测量了EGFP-39TAG的表达，
MCU抑制剂RU265的一个含二茂密的类似物，细胞通透性增加
化学与化学生物学区域，康奈尔大学，伊萨卡，纽约14853，美国。 摘要线粒体钙Uniporter（MCU）是一种跨膜蛋白，可介导线粒体钙（M Ca 2+）摄取。 MCU的抑制剂对于它们的应用是研究M Ca 2+摄取在细胞功能上的作用的工具。 在这项研究中，我们报告了两个有效的MCU抑制剂，[RU 2（μ-N）（NH 3）8（FCCO 2）2]（OTF）3（RUOFC，FC = Ferrecene，OTF = Triflate）和[RU 2（μ-N）（μ-N）（μ-N）（μ-n）（nh 3）（nh 3）8（phco 2）8（phco 2）2]（phco 2]（oobz）3（OOBZ）3（robz）。 这些化合物是先前报道的抑制剂[RU 2（μ-N）（NH 3）8（Cl）2]（Cl）3（RU265）的类似物，分别用铁甲基辅助辅助酯和苯甲酸酯和苯甲酸酯配体衍生。 两种化合物均通过NMR光谱，红外光谱和X射线晶体学合成并充分表征。 在生理条件下，Ruofc和Ruobz Aquate的半衰期分别为2.9和6.5 h，以产生[RU 2（μ-N）（NH 3）8（H 2 O）2]（OTF）5（RU265ʹ）和游离羧酸盐。 在N，Nʹ-二甲基甲酰胺（DMF）中RUOFC的环状伏安法揭示了在0.64 V VS SCE处的突出的可逆2E转移事件，对应于两种二甲苯基轴向轴向配体的同时氧化。 所有三个复合物还表现出不可逆的RU基于RU的减少，在–1 V Vs SCE的电位下。 RU265'，RUOFC和RUOBZ的DFT计算确认RUOFC的氧化还原活性是由二革新配体引起的。 此外，这三种化合物的Lumo能量与它们不可逆的还原电位相关。 17,18化学与化学生物学区域，康奈尔大学，伊萨卡，纽约14853，美国。摘要线粒体钙Uniporter（MCU）是一种跨膜蛋白，可介导线粒体钙（M Ca 2+）摄取。MCU的抑制剂对于它们的应用是研究M Ca 2+摄取在细胞功能上的作用的工具。 在这项研究中，我们报告了两个有效的MCU抑制剂，[RU 2（μ-N）（NH 3）8（FCCO 2）2]（OTF）3（RUOFC，FC = Ferrecene，OTF = Triflate）和[RU 2（μ-N）（μ-N）（μ-N）（μ-n）（nh 3）（nh 3）8（phco 2）8（phco 2）2]（phco 2]（oobz）3（OOBZ）3（robz）。 这些化合物是先前报道的抑制剂[RU 2（μ-N）（NH 3）8（Cl）2]（Cl）3（RU265）的类似物，分别用铁甲基辅助辅助酯和苯甲酸酯和苯甲酸酯配体衍生。 两种化合物均通过NMR光谱，红外光谱和X射线晶体学合成并充分表征。 在生理条件下，Ruofc和Ruobz Aquate的半衰期分别为2.9和6.5 h，以产生[RU 2（μ-N）（NH 3）8（H 2 O）2]（OTF）5（RU265ʹ）和游离羧酸盐。 在N，Nʹ-二甲基甲酰胺（DMF）中RUOFC的环状伏安法揭示了在0.64 V VS SCE处的突出的可逆2E转移事件，对应于两种二甲苯基轴向轴向配体的同时氧化。 所有三个复合物还表现出不可逆的RU基于RU的减少，在–1 V Vs SCE的电位下。 RU265'，RUOFC和RUOBZ的DFT计算确认RUOFC的氧化还原活性是由二革新配体引起的。 此外，这三种化合物的Lumo能量与它们不可逆的还原电位相关。 17,18抑制剂对于它们的应用是研究M Ca 2+摄取在细胞功能上的作用的工具。在这项研究中，我们报告了两个有效的MCU抑制剂，[RU 2（μ-N）（NH 3）8（FCCO 2）2]（OTF）3（RUOFC，FC = Ferrecene，OTF = Triflate）和[RU 2（μ-N）（μ-N）（μ-N）（μ-n）（nh 3）（nh 3）8（phco 2）8（phco 2）2]（phco 2]（oobz）3（OOBZ）3（robz）。这些化合物是先前报道的抑制剂[RU 2（μ-N）（NH 3）8（Cl）2]（Cl）3（RU265）的类似物，分别用铁甲基辅助辅助酯和苯甲酸酯和苯甲酸酯配体衍生。两种化合物均通过NMR光谱，红外光谱和X射线晶体学合成并充分表征。在生理条件下，Ruofc和Ruobz Aquate的半衰期分别为2.9和6.5 h，以产生[RU 2（μ-N）（NH 3）8（H 2 O）2]（OTF）5（RU265ʹ）和游离羧酸盐。在N，Nʹ-二甲基甲酰胺（DMF）中RUOFC的环状伏安法揭示了在0.64 V VS SCE处的突出的可逆2E转移事件，对应于两种二甲苯基轴向轴向配体的同时氧化。所有三个复合物还表现出不可逆的RU基于RU的减少，在–1 V Vs SCE的电位下。RU265'，RUOFC和RUOBZ的DFT计算确认RUOFC的氧化还原活性是由二革新配体引起的。此外，这三种化合物的Lumo能量与它们不可逆的还原电位相关。17,18对RU265，RUOFC和RUOBZ的生物学特性进行了系统的比较。RUOFC和RUOBZ都抑制了透化HEK293T细胞中M Ca 2+的摄取，但比RU265的有效性低5-7倍。在完整的细胞中，Ruobz被细胞吸收，并以与RU265相似的程度抑制MCU。RUOFC在RU265上表现出10倍的细胞摄取增加，这又导致完整细胞中MCU抑制活性的增强也适度。此外，与RU265相比，RUOFC对HEK293T和HELA细胞具有细胞毒性，其生长抑制浓度分别为23.2和33.9μm，可以利用该特性，这些特性可用于开发MCU推动的抗癌剂。这些结果将RUOFC作为一种有效的MCU抑制剂建立，并且是RU265的轴向配体功能化如何导致具有不同物理和生物学特性的新化合物的另一个例子。简介线粒体钙（M Ca 2+）在广泛的生物学过程中起重要作用，这对于细胞功能至关重要。1,2 M Ca 2+的摄取由线粒体钙Uniporter（MCU）实施，这是一种高度选择性的内部整流Ca 2+通道。3–5升高的M Ca 2+水平与多种病理状况有关，包括缺血再灌注损伤，8,9癌症，10-12和神经退行性疾病。13–16鉴于M Ca 2+参与这些人类疾病，人们对开发可以抑制MCU的化合物越来越兴趣，以防止M Ca 2+过载。13–16鉴于M Ca 2+参与这些人类疾病，人们对开发可以抑制MCU的化合物越来越兴趣，以防止M Ca 2+过载。
时间和剂量依赖性的播种趋势在细胞中的外源性tau R2和R3聚集体
tauopathies是一组神经退行性疾病，分为三种类型，分为3R，4R或3RÞ4R（混合）tauopathies，基于构成异常含量的TAU同工型。据认为所有六个TAU同工型具有功能特征。然而，与不同的呼吸病相关的神经病理病理学的差异提供了一种可能性，疾病的进展和tau的积累可能会因同工型组成而有所不同。微管结合结构域中的重复2（r2）定义了同工型的类型，这可能会影响与特定TAU同工型相关的TAU病理学。因此，我们的研究旨在确定使用HEK293T生物传感器细胞的R2和重复3（R3）聚集体的差异差异。我们表明，由R2诱导的播种通常高于R3聚集体，较低浓度的R2聚集体能够诱导播种。接下来，我们发现R2和R3聚集物均剂量依赖性地增加了Triton-溶于剂的Ser262天然Tau的磷酸化，尽管在较高浓度（12.5 nm或100 nm）的R2和R3聚集体的细胞中，该细胞在较高的R2聚集物中播种，但在72小时的浓度下，R2和R3聚集体可见。然而，在用R2诱导的细胞中可见Triton-不溶pser262 tau的积累比R3聚集体中可见。我们的发现表明R2区域可能有助于早期和增强tau聚集的诱导，并定义4R tauopathies疾病进展和神经病理学的差异。©2023 Elsevier Inc.保留所有权利。
CRISPR 转录激活因子的特殊调节......
摘要 细胞转录本编码有关细胞身份和疾病状态的重要信息。响应 RNA 生物标志物激活 CRISPR 有可能以时空精度控制 CRISPR 活性。这将能够将 CRISPR 活性限制在表达目标 RNA 生物标志物的特定细胞类型，同时防止其他细胞中出现不必要的活性。在这里，我们提出了一个简单而具体的平台，用于通过工程化脓性链球菌 Cas9 单向导 RNA (sgRNA) 来调节响应 RNA 检测的 CRISPR 活性。sgRNA 被设计成折叠成复杂的二级结构，在基态下抑制其活性。工程化的 sgRNA 在识别互补 RNA 后被激活，从而使 Cas9 能够发挥其功能。我们的方法使 CRISPR 能够在 HEK293T 细胞和斑马鱼胚胎中响应 RNA 检测而激活。迭代 21 设计优化允许开发用于生成能够检测所选 RNA 序列的 sgRNA 22 的计算工具。机制研究表明，工程 23 sgRNA 在 RNA 检测过程中被切割，并且我们确定了受益于 24 化学修饰的关键位置，以提高工程 sgRNA 在体内的稳定性。我们的传感器为使用 CRISPR 26 激活来响应内源性 RNA 生物标志物开发新的研究和治疗应用开辟了新的机会。 27