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TALEN 介导的 HSPC 内含子编辑可以
（未经同行评审认证）是作者/资助者。保留所有权利。未经许可不得重复使用。此预印本的版权所有者此版本于 2024 年 3 月 5 日发布。；https://doi.org/10.1101/2024.03.05.583596 doi：bioRxiv preprint
XPO1 抑制剂选择性靶向 TET2 突变的 HSPC
此预印本的版权所有者此版本于 2022 年 10 月 13 日发布。；https://doi.org/10.1101/2022.10.12.511957 doi：bioRxiv preprint
间充质基质细胞改善 CRISPR-Cas9 基因编辑的人类 HSPC 的移植结果
间充质基质细胞 (MSC) 已用于体外支持造血干细胞和祖细胞 (HSPC) 扩增和体内促进 HSPC 植入。基于这些研究，我们开发了一种基于 MSC 的共培养系统，以优化成簇的规则间隔短回文重复序列 (CRISPR)-Cas9 基因编辑 (GE) 人类 HSPC 的移植结果。我们表明，骨髓 (BM)-MSC 产生多种造血支持和抗炎因子，能够缓解增殖停滞并减轻 GE-HSPC 中激活的凋亡和炎症程序，从而提高其体外扩增和克隆形成潜力。使用 BM-MSC 可实现更佳的人体植入，并增加 GE-HSPC 的克隆产量，从而促进移植小鼠外周血的早期血液重建。总之，我们的工作为 BM-MSC 的新临床应用提供了生物学基础，以促进 GE-HSPC 的植入并改善其移植结果。
通过 CRISPR 基因组编辑在人类 HSPC 中建立多重 HDR 疾病和 SCID 校正模型
。CC-BY-NC-ND 4.0 国际许可证（未经同行评审认证）是作者/资助者，他已授予 bioRxiv 永久展示预印本的许可。
用于基因校正和基因插入的非病毒单链 DNA 模板的环化可改善 HSPC 中的编辑结果
利用 TALEN® 技术，我们开发了一种基因编辑过程，通过同源性定向修复在造血干细胞和祖细胞 (HSPC) 中实现高效的基因校正和基因插入。我们首先评估了非病毒线性单链 DNA (LssDNA) 供体模板递送策略与更常用的病毒 (AAV) 递送的潜力。这两种策略均导致基因在体外插入 HSPC。然后，我们比较了 LssDNA 与环化单链 DNA (CssDNA) 的使用情况。我们发现环化显著提高了敲入 (KI) 效率，相对于其线性对应物。有趣的是，KI 的这种增加分别与环状和线性 ssDNA 编辑细胞中更高的存活率和更低的敲除 (KO) 相关。总体而言，我们表明，与 TALEN® 基因编辑相关的非病毒 ssDNA 传递可在长期重新植入的造血干细胞中实现高水平的基因校正。ssDNA 的环化有可能进一步提高 KI 的速率，而不会影响细胞活力和适应性，从而促进下一代细胞疗法的发展。
超声可编程的氢键有机框架，用于Sono-femogenetics
预印本（未通过同行评审认证）是作者/资助者。保留所有权利。未经许可就不允许重复使用。该版本的版权持有人于2023年12月13日发布。 https://doi.org/10.1101/2023.12.13.571396 doi：Biorxiv Preprint
使用 CRISPR/Cas9 和 53BP1 抑制技术通过靶向 CYBB cDNA 插入来修复 X-CGD 患者的 HSPC，从而增强同源性定向修复
蛋白质。我们在此报告了通过同源定向修复在患者造血干细胞/祖细胞 (HSPC) 中进行基因校正，使用 CRISPR/Cas9 将腺相关病毒供体的 CYBB 外显子 1-13 或 2-13 cDNA 靶向插入内源性 CYBB 外显子 1 或外显子 2 位点。外显子 1-13 cDNA 的靶向插入不会恢复生理 gp91 phox 水平，这与 CYBB 表达对内含子 1 的要求一致。然而，外显子 2-13 cDNA 的插入完全恢复了吞噬细胞分化时 gp91 phox 和 ROS 的产生。添加土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件不会进一步增强外显子 2-13 校正细胞中的 gp91 phox 表达，表明保留内含子 1 足以实现最佳 CYBB 表达。使用 i53 mRNA 暂时抑制非同源末端连接，靶向校正增加了约 1.5 倍。在 NSG 小鼠中植入后，校正后的 HSPC 产生了吞噬细胞，并恢复了 gp91 phox 和 ROS 的产生。我们的研究结果证明了
造血茎和祖细胞中高效的基因组编辑
Key points: - IVTsgRNAs in K562 predict response to highly effective genome editing in HSPCs - Low cost and efficient nucleofection protocols for RNP based editing in K562 and HSPCs - Genome editing efficiencies in HSPCs up to 80% is independent of cell number, and CD34 subpopulations are equally sensitive for genome editing - CRISPR-Cas9 gene editing does not impact细胞增殖和分化或长期p21诱导细胞衰老
人类CD34+造血茎和祖细胞中的基因敲除以及小鼠的人类免疫系统
人类CD34 +造血干细胞和祖细胞（HSPC）是临床HSC移植的标准细胞来源，以及实验性异种移植，以产生“人性化小鼠”。为了进一步扩展这些人源性小鼠的应用范围，我们开发了一种方案，以在移植前有效地编辑人CD34 + HSPC的基因组。过去，操纵HSPC在体外培养过程中本质上难以转导，并且在体外培养过程中迅速失去其干性和植入潜力，这使操纵HSPC变得复杂。然而，使用SGRNA的优化核反射：CAS9核糖核蛋白复合物，我们现在能够在具有几乎100％效率的CD34 + HSPC中编辑候选基因，并在具有高I IntrineAge srimineage syprineage hampopooietic smatopoietic的较高的小鼠中将这些修饰的细胞移植在免疫缺陷的小鼠中。结果是一种人源化的小鼠，我们从中从其人类免疫系统中删除了感兴趣的基因。
工程干细胞抗体配对逃避1（...
我们的主要抗 CD117 mAb mAb-7 与未编辑的 HSPC 具有高亲和力，但与 CD117 编辑的细胞不结合（图 4）。mAb-7 与 CD117 结合可阻断 SCF-CD117 相互作用（图 4），从而选择性抑制未编辑 HSPC 的存活（图 5、6）。体外用 mAb-7 处理 HSPC 导致未编辑 HSPC 活力降低 85% 以上，而 CD117 编辑的细胞不受影响（图 5、6）。由于 CD117 信号传导与肥大细胞脱颗粒有关，我们评估了天然和 Fc 工程化版本的 mAb-7 对体外培养分化的肥大细胞的影响。Fc 工程化版本的 mAb-7 在体外不会导致任何程度的肥大细胞脱颗粒（图 6）。我们在体外比较了我们修饰的 CD117 与野生型 CD117 的磷酸化（图 7）。我们的 CD117 变体蛋白正常与 SCF 结合，在 SCF 结合后经历了相似水平的磷酸化（与 WT 蛋白相比）。我们在 HSPC 中实现了约 80% 的双等位基因 CD117 编辑和近乎完全的 HBG1/2 基因座编辑（图 8）。在异种移植研究中，我们观察到 CD117 编辑的 HSPC 能够在免疫功能低下的小鼠中进行长期多谱系造血植入（图 9）。重要的是，mAb-7 治疗导致仅使用未编辑的人类 CD34+ 细胞人源化的小鼠的人类嵌合体以及骨髓 CD34+ 细胞频率显着降低。有趣的是，在接受编辑：未编辑混合物的小鼠中，mAb-7 导致 CD117 编辑细胞在整个骨髓和 CD34+ 细胞区室中富集，这由这些区室中的高编辑水平表明（图 10）。