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基石研讨会
* Matthew Porteus，美国斯坦福大学医学院 * Laura Sepp-Lorenzino，美国 Intellia Therapeutics 公司 Romina Marone，瑞士巴塞尔大学，DBM 保留功能的单个氨基酸替代可保护造血干细胞和祖细胞免受体内 CD117 靶向免疫治疗的侵害 Gabriele Casirati，美国波士顿儿童医院 / 丹娜法伯癌症研究所 多重表位工程 HSPC 可实现针对急性髓系白血病的多靶点 CAR-T 细胞免疫治疗 Samuele Ferrari，意大利圣拉斐尔生命健康大学 揭示造血干细胞中碱基编辑和主要编辑的优点和缺点 Ayal Hendel，以色列巴伊兰 通过 CRISPR 基因组编辑在健康供体人类 HSPC 中多重 HDR 以校正 SCID 模拟 Sean McCutcheon，美国杜克大学基于 CRISPR 的表观基因组编辑筛选可识别人类 CD8 T 细胞功能的转录和表观遗传调控因子
编辑 γ 珠蛋白阻遏物结合位点可恢复胎儿血红蛋白合成并纠正镰状细胞病表型
镰状细胞病 (SCD) 是由成人血红蛋白 (Hb) 链中的单个氨基酸变化引起的，这种变化会导致 Hb 聚合和红细胞 (RBC) 镰状化。导致胎儿 珠蛋白在成年期产生的突变共同遗传，胎儿 Hb 的遗传性持续性 (HPFH) 降低了 SCD 的临床严重程度。HBG 珠蛋白启动子中的 HPFH 突变会破坏阻遏物 BCL11A 和 LRF 的结合位点。我们使用 CRISPR-Cas9 通过产生插入和缺失来模拟 HBG 启动子中的 HPFH 突变，从而导致已知和推定的阻遏物结合位点的破坏。编辑患者来源的造血干/祖细胞 (HSPC) 中的 LRF 结合位点可导致 珠蛋白去阻遏和镰状表型的纠正。用靶向 LRF 结合位点的 gRNA 处理的 HSPC 异种移植在重新植入 HSPC 方面表现出较高的编辑效率。这项研究确定了 LRF 结合位点是基因组编辑治疗 SCD 的有力靶点。
Prabhakara（Prabha）Nagareddy，M.Pharm，M.Sc.，Phd，Faha
我实验室中的研究广泛地集中在理解心脏代谢疾病中动脉粥样硬化风险的病理基础上。在这方面，我们一直在研究NLRP3炎性体信号在髓样细胞中的作用，特别是中性粒细胞和巨噬细胞。我们已经确定了某些激活NLRP3炎性体的嗜中性粒细胞衍生的警报分子（即S100A8/A9），并促进促炎细胞因子的释放。这些细胞因子传播到骨髓，与骨髓（BM）中的不同造血茎和祖细胞（HSPC）相互作用，以刺激异常的脊髓脉和血栓形成，从而增加了动脉粥样硬化的风险。因此，我们的重点主要是确定与BM中与HSPC相互作用的炎症提示/信号传导介质以促进全身炎症。我们的短期目标是验证和重新利用某些FDA批准的药物以靶向急性和慢性炎症，以改善心脏代谢结果。长期目标是利用我们的研究和其他人的知识来制定新颖的治疗策略，以减轻心血管和心脏代谢性疾病的整体负担。奖项/荣誉： div>
精确的 CRISPR-Cas 介导的基因修复，最大程度减少失活......
尽管 CRISPR-Cas9 是基因治疗发展的关键，但其潜在的脱靶突变仍然是一个主要问题。在这里，我们建立了一种“间隔缺口”基因校正方法，将 Cas9 D10A 切口酶与一对相距 200 到 350 bp 的 PAM-out sgRNA 相结合。结合腺相关病毒 (AAV) 血清型 6 模板递送，我们的方法可在人类造血干细胞和祖细胞（HSPC 包括长期 HSC）和 T 细胞中实现有效的 HDR，同时将 NHEJ 介导的靶突变降至最低。利用间隔缺口，我们开发了一种修复 HBB 、 ELANE 、 IL7R 和 PRF1 基因中发生的致病突变的方法。我们实现了 20% 到 50% 的基因校正效率，同时将 NHEJ 介导的靶突变降至最低。根据深入的脱靶评估，经典 CRISPR-Cas9 诱导的频繁非预期遗传改变在用间隔缺口处理的 HSPC 中显著减少或消失。因此，间隔缺口基因校正方法为基因治疗提供了更高的安全性和适用性。
单链DNA供体模板的圆形化释放了长期HSC编辑的非病毒基因递送的能力
在过去的十年中，非病毒DNA模板递送已与工程核酸酶一起使用，以靶向造血茎和祖细胞中的单链DNA序列。虽然对基因治疗有效，但该方法仅限于简短的DNA供体模板，从而限制了其对基因矫正的应用。为了扩大其范围，我们使用千层长的圆形单链DNA供体模板和TALEN技术开发了一个编辑过程。我们的结果表明，CSSDNA编辑过程可在可行的HSPC中实现高基因插入频率。与常规的AAV编辑过程相比，CSSDNA编辑的HSPC显示出更高的植入和维持鼠模型中基因编辑的倾向。这种积极的结果部分是由于较高水平的原始编辑的HSPC，更静止的代谢状态以及骨髓粘附标记的表达升高。我们的发现突出了CSSDNA作为基因治疗应用的通用和有效的非病毒DNA模板的强大潜力。
整体和局部操纵 DNA 修复机制以改变造血干细胞中位点特异性基因编辑结果
血液系统的单基因疾病有可能通过体外自体干细胞移植来治疗，移植的是经过基因改造的造血干细胞和祖细胞 (HSPC)。sgRNA/Cas9 系统允许以单核苷酸分辨率精确修改基因组。然而，该系统依赖于内源性细胞 DNA 修复机制来修复 Cas9 诱导的双链断裂 (DSB)，无论是通过非同源末端连接 (NHEJ) 途径还是通过细胞周期调节的同源定向修复 (HDR) 途径。在这里，我们描述了一组异位表达的 DNA 修复因子和 Cas9 变体，评估它们在 HBB 基因座上通过 HDR 促进基因校正或通过 NHEJ 抑制基因破坏的能力。尽管 DNA 修复因子的短暂整体过度表达不会提高原代 HSPC 中基因校正的频率，但通过与 Cas9 蛋白融合将因子定位到 DSB 确实改变了修复结果，朝着微同源介导的末端连接 (MMEJ) 修复（HDR 事件）的方向发展。当可预测的基因编辑结果对于治疗成功至关重要时，这种策略可能很有用。
全面分析并准确量化 CRISPR-Cas9 基因编辑引起的意外大型基因修饰
迄今为止，大多数基因组编辑分析都是基于量化小插入和缺失。在这里，我们表明 CRISPR-Cas9 基因组编辑可以在不同的原代细胞和细胞系中诱导较大的基因修饰，例如缺失、插入和复杂的局部重排。我们使用不同的方法分析了造血干细胞和祖细胞 (HSPC) 中的大型缺失事件，包括克隆基因分型、液滴数字聚合酶链反应、具有唯一分子标识符的单分子实时测序和长扩增子测序分析。我们的结果表明，在 HSPC 中的 HBB（11.7 至 35.4%）、HBG（14.3%）和 BCL11A（13.2%）基因以及 T 细胞中的 PD-1（15.2%）基因的 Cas9 靶向切割位点处，高达数千个碱基的大量缺失以高频率发生。我们的发现对于推进基因组编辑技术治疗人类疾病具有重要意义，因为非预期的大规模基因修饰可能会持续存在，从而改变生物学功能并减少可用的治疗等位基因。
抗坏血酸支持循环造血干细胞体外生成浆细胞样树突状细胞
摘要浆细胞样树突状细胞 (pDC) 是一种具有多方面功能的稀有免疫细胞，但由于可从血液中提取的细胞数量稀少，它们作为细胞免疫疗法的潜在用途受到挑战。在这里，我们系统地研究了从造血干细胞和祖细胞 (HSPC) 生成 pDC 的培养参数。使用优化条件结合 HSPC 预扩增的实施，我们从 100,000 个脐带血衍生的 HSPC 开始生成平均 4.65 亿个 HSPC 衍生的 pDC (HSPC-pDC)。此外，我们证明这种方案允许从全血 HSPC 生成 HSPC-pDC，并且这些细胞显示出 pDC 表型和功能。使用符合 GMP 的培养基，我们观察到 TLR7/9 反应显著丧失，通过补充抗坏血酸可以挽救这种丧失。抗坏血酸诱导与 pDC 特异性先天免疫途径相关的转录特征，表明抗坏血酸对 pDC 功能具有未知作用。这构成了从全血中生成 pDC 的第一个方案，并为研究 HSPC-pDC 的细胞免疫疗法奠定了基础。
CRISPR-Cas9 介导的造血干细胞和祖细胞 ELANE 突变校正可治疗严重先天性中性粒细胞减少症
严重先天性中性粒细胞减少症 (SCN) 是一种单基因疾病。SCN 患者容易发生复发性危及生命的感染。SCN 的主要原因是 ELANE 基因的常染色体显性突变导致中性粒细胞分化受阻。在本研究中，我们使用 CRISPR-Cas9 核糖核蛋白和腺相关病毒 (AAV)6 作为供体模板递送系统来修复 SCN 患者来源的造血干细胞和祖细胞 (HSPC) 中的 ELANE L172P 突变。我们使用了专门针对突变等位基因的单向导 RNA (sgRNA) 和针对 ELANE 外显子 4 的 sgRNA。使用后者 sgRNA，原则上可以修复 34% 的已知 ELANE 突变。我们在 SCN 患者来源的 HSPC 中实现了高达 40%（使用 sg ELANE -ex4）和 56%（使用 sg ELANE - L172P）的基因校正效率。在将 HSPC 移植到人源化小鼠中后，基因修复在体外和体内恢复了中性粒细胞分化。成熟的编辑中性粒细胞表达正常的弹性蛋白酶水平，并在功能测定中表现正常。因此，我们为使用 CRISPR-Cas9 纠正患者来源的 HSPC 中的 ELANE 突变提供了原理证明，这可能转化为 SCN 的基因治疗。
造血干细胞同源基因编辑的进展与障碍
基因修饰或插入最初于 20 世纪 70 年代初提出作为治疗遗传性疾病的方法 [ 1 ]。造血干细胞 (HSC) 是基因治疗的首选目标，因为它们能够维持终生造血，从而能够持久缓解一系列疾病。目前，遗传性血液疾病的基因治疗方法主要包括从患有潜在遗传缺陷的个体中提取造血干细胞和祖细胞 (HSPC)，并在体外进行基因修饰后进行过继转移（图 1 a）。数十年来在临床上进行的同种异体 HSPC 移植为这种新方法的治疗转化提供了路线图。在自体移植基因修饰的 HSPC 时，可以避免同种异体反应性并发症并降低预处理方案的复杂性，与同种异体 HSPC 移植相比，它们具有显著优势。使用基于 γ 逆转录病毒载体的基因递送载体的临床试验最初于 20 世纪 90 年代获得批准，但仅检测到少量校正细胞，并且未观察到潜在缺陷的表型校正。重新关注优化体外转导条件和增加预处理方案以利于转导细胞的植入，导致在原发性免疫缺陷患者中首次获得明确的临床成功[2-4]。然而，随后报告称接受治疗的患者中载体介导的原癌基因插入激活导致恶性肿瘤[5-7]，这鼓励了主要基于 HIV-1 慢病毒亚家族逆转录病毒的替代载体设计的开发（图 1b）。慢病毒载体的独特成分促进其在非分裂的 HSPC 内的核易位，进一步增强这些细胞的转导。这些载体中 3′-LTR 启动子和增强子元件的消除也提供了一个关键的自失活 (SIN) 安全特性，以减轻对可能与内源性 HIV 颗粒重组或载体整合基因组位点附近原癌基因意外激活的担忧。然而，对于这些 SIN 载体，转基因表达的效率高度依赖于添加