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通过 CRISPR 辅助 ssODN 介导的同源定向修复对绵羊进行 Otoferlin 基因编辑
OTOF 基因编码耳蜗内毛细胞中表达的耳蜗蛋白，其不同突变会诱发一种耳聋，而耳聋是人类无综合征隐性听觉神经病谱系障碍的主要原因。我们报告了使用与不同 Cas9 成分（mRNA 或蛋白质）相关的 CRISPR 系统，在单链寡脱氧核苷酸 (ssODN) 辅助下诱导同源定向修复 (HDR)，生成了第一个 OTOF 突变大型动物模型。使用不同浓度的两个靶向外显子 5 和 6 的 sgRNA 与 Cas9 mRNA 或蛋白质 (RNP) 结合，并与靶向外显子 5 中 HDR 的 ssODN 模板混合，该模板包含两个 STOP 序列。共出生 73 只羔羊，其中 13 只出现插入/缺失突变（17.8%），其中 8 只（61.5%）通过 HDR 发生敲入突变。较高浓度的 Cas9-RNP 能更有效地诱导靶向突变，但对胚胎存活率和妊娠率有负面影响。本研究首次报道了 OTOF 破坏绵羊的产生，这可能有助于更好地理解和开发与遗传疾病相关的人类耳聋的新疗法。这些结果支持使用 ssODN 辅助的 CRISPR/Cas 系统作为牲畜基因编辑的有效工具。
Zymo-Seq™ SPLAT DNA 文库试剂盒
产品描述 Zymo-Seq™ SPLAT DNA 文库试剂盒是一种多功能解决方案，可用于从各种样本类型中制备 DNA 文库。通过应用独特的单链文库制备方法——夹板连接接头标记 (SPLAT) 1 ，可以轻松地从基因组 DNA、无细胞 DNA 甚至 FFPE 衍生的 DNA 中制备 DNA 文库。此外，SPLAT 技术允许将接头直接连接到每个 DNA 片段的天然末端，同时消除了末端修复的需要并确保保留所有原始核苷酸。此功能可通过揭示整个 DNA 片段中的更多 SNP、INDEL 和变体来提高测序性能。 Zymo-Seq™ SPLAT DNA 文库试剂盒只需两个简单步骤即可轻松生成 10 ng 至 500 ng 预片段化 DNA 输入文库：(a) 同时将单链 DNA 与独特的夹板接头连接，以及 (b) 使用独特的双索引通过 PCR 扩增文库。通过采用高效且用户友好的简单工作流程，Zymo-Seq™ SPLAT DNA 文库试剂盒可在短短 3 小时内生成可用于 DNA 测序的高质量文库。
ASP 2024抽象书
成功的CRISPR/CAS介导的基因组编辑取决于在特定的DNA序列下的双链断裂（DSB）的诱导以及随后的错误修复机制的启动。但是，影响CRISPR/CASPR介导的DSB效率和维修保真度的因素在植物中仍未探索。这项研究使用Nicotiana Benthamiana探索DSB修复机制对CAS9和CAS12A酶的编辑效率的影响。测试了基因间（BUR2启动子）和外显子（RDR1）区域中的多个目标位点，以测试在体外和体内编辑中裂解的敏感性。目标部位之间的体内编辑和体外切割效率差异很大。此外，体内编辑效率没有反映体外切割效率。这些结果表明，通过DNA修复机制进行完美的重新连接会损害明显的编辑效率，这表明Indel积累可能无法准确反映CRISPR/CASPR/CAS介导的基因组编辑效率。可以成功设计在DSB修复期间量化和减少完美重新连接的工厂系统。对该系统进行的正在进行的测试表明，不同的CAS酶在DSB修复过程中具有不同级别的完美重新搭配，提供了见解，以进一步优化植物中的编辑策略。
利用牛津纳米孔技术公司的自适应采样技术进行药物基因组学中的靶向单倍型分析
药物基因组学 (PGx) 研究个体间基因组变异对药物反应的影响，从而有机会为每位患者量身定制给药方案。目前有针对性的 PGx 测试平台主要基于微阵列、聚合酶链式反应或短读测序。尽管这些检测在识别单核苷酸变异 (SNV) 和插入/缺失 (INDEL) 方面表现出巨大价值，但它们无法识别大的结构变异，也无法进行明确的单倍型分型以进行星号等位基因分配。在这里，我们使用 Oxford Nanopore Technologies 的自适应采样来丰富从药物基因组学知识库 (PharmGKB) 中提取的具有充分记录的 PGx 相关性的 1,036 个基因面板。通过评估与现有真实集的一致性，我们展示了对五个瓶中基因组参考样本的准确变异和星号等位基因调用。我们表明，最多可以在一个 PromethION 流动槽上复用三个样本，而不会显著降低变异调用性能，从而分别实现 99.35% 和 99.84% 的目标变异召回率和精确度。这项工作推动了纳米孔测序在临床 PGx 环境中的使用。
利用 PCR 毛细管凝胶电泳高通量基因分型追踪苹果中 CRISPR/Cas12a 介导的基因组编辑事件
摘要：使用新型 CRISPR/Cas12a 系统具有优势，因为它与常用的 CRISPR/Cas9 系统相比具有不同的特点，从而扩展了基因组编辑 (GE) 应用的可能性。在这项工作中，CRISPR/Cas12a 系统首次应用于苹果，以研究其在 GE 应用中的普遍可用性。通过体外切割试验预先筛选出针对内源报告基因 MdPDS 不同外显子的有效引导 RNA，该基因的破坏会导致白化表型。将一个构建体转移到苹果中，该构建体编码 CRISPR/Cas12a 系统，该系统同时靶向 MdPDS 中的两个基因座。使用荧光 PCR 毛细管电泳和扩增子深度测序，所有已鉴定的再生白化芽的 GE 事件都被描述为缺失。未观察到两个相邻靶位点之间的大量缺失。此外，还经常观察到表现出多个 GE 事件的再生体和芽的嵌合组成。通过比较两种分析方法，结果表明荧光 PCR 毛细管凝胶电泳是一种灵敏的高通量基因分型方法，可以同时准确预测多个位点的插入/缺失突变的大小和比例。特别是对于表现出高嵌合频率的物种，可以推荐将其作为有效选择同型组蛋白 GE 系的经济有效的方法。
请引用本文：O. Sachenkova Lundström、M. Verbiest、F. Xia、H. Ziaei jam、I. Zlobec、M. Anisimova、M. Gymrek、WebSTR：一项全民
新一代测序 (NGS) 的进步使得人们能够生成人类遗传变异的深度目录，并发现了大量与疾病相关的变异。大多数 NGS 应用都集中在单核苷酸多态性 (SNP) 或短插入和缺失 (indel) 上。串联重复是遗传变异的另一个丰富来源，由于难以获得准确的基因型，因此在很大程度上被忽视了。在这里，我们主要关注重复单元长度为 1-6 bp 的短串联重复 (STR)。总的来说，STR 占人类基因组的约 3%，超过整个蛋白质编码外显子组 [1]。STR 在基因调控区富集 ([2],[3])，重复拷贝数的变化可以通过多种机制影响基因调控，包括修改转录因子结合位点、改变 DNA 甲基化模式 [4] 或其他方式。 STR 中重复单元数量的大幅增加与数十种疾病 [5] 有关，例如亨廷顿氏病 [6] 和脆性 X 综合征 [7]，而较温和的逐步变化与包括血液和脂质生物标志物在内的复杂性状有关 ([8], [9])。STR 还被用作癌症研究中诊断的遗传标记，并在多种癌症中发挥作用，包括结直肠癌 [10] 和乳腺癌 [11]。
重组AAV在精准基因组编辑中的作用
自从大约 50 年前发现以来，复制缺陷型、无致病性、几乎无处不在的单链腺相关病毒 (AAV) 就变得越来越重要。它们独特的生命周期和病毒-细胞相互作用促使重组 AAV 成为理想的基因医学工具，并已发展成为有效的商业化基因疗法。AAV 的一个显着特性是它们能够精确编辑基因组。与所有当前的基因组编辑平台相比，AAV 专门利用高保真同源重组 (HR) 途径，不需要外源核酸酶来预先切割基因组 DNA。总之，这可以实现高度精确的编辑结果，既能保持基因组完整性，又不会在目标位点掺入插入/缺失突变或病毒序列，同时也消除了脱靶基因毒性的可能性。发现干细胞衍生的 AAV (AAVHSC) 能够介导精确而有效的 HR，具有较高的靶向准确性和高效率。AAVHSC 编辑在体内有丝分裂后细胞和组织中有效发生。此外，AAV 还具有内在传递机制的优势。因此，这种独特的基因组编辑平台在纠正与疾病相关的突变而不增加突变负担方面具有巨大的前景。本综述将重点介绍直接 AAV 介导的基因组编辑的独特属性及其潜在的作用机制。
利用 prime 编辑系统高效生成小鼠模型
亲爱的编辑，人类的大多数遗传疾病是由单核苷酸突变引起的。尽管使用基于 CRISPR 的胞嘧啶碱基编辑器 (CBE) 1 或腺嘌呤碱基编辑器 (ABE) 2 进行基因组编辑对于某些遗传疾病中 C 到 T 和 A 到 G 碱基替换的基因校正大有希望 3,4，但这两种编辑器对于纠正其他变异（如碱基颠换、小插入和缺失 (indel)）均无效。prime editing 系统是一种“搜索和替换”基因组编辑技术，最近被添加到基因组编辑工具包 5 中。prime editors (PEs) 结合了外源性 CRISPR/Cas9 系统和内源性 DNA 修复系统，以实现更大的编辑多功能性，诱导 CBE 和 ABE（C → T、G → A、A → G 和 T → C）之外的所有类型的碱基到碱基转换、小插入/缺失及其组合。基因组编辑系统从PE1进化到PE3（PE3b），效率逐步提高5。PE1的执行器由工程化的Cas9切口酶与逆转录酶（M-MLV RTase）5融合构建，可靶向基因组位点，切口DNA并引发逆转录（RT）。执行器结合工程化的基因组编辑向导RNA（pegRNA）寻找并切口目标DNA，从而通过RT将新的遗传信息编码到基因组中。然后，对M-MLV RTase引入突变以提高PE1的编辑效率，此PE2被称为PE2。随后，在PE3b中，执行器与工程化的Cas9切口酶5融合，可靶向基因组位点，切口DNA并引发逆转录（RT）。执行器与工程化的基因组编辑向导RNA（pegRNA）结合，寻找并切口目标DNA，从而通过RT将新的遗传信息编码到基因组中。然后，对M-MLV RTase引入突变以提高PE1的编辑效率，此PE2被称为PE2。
介导的NK细胞的靶向靶向肿瘤...
最近，与神经发育和神经退行性障碍NEDAMS（随着回归，异常运动，言语丧失和癫痫发作）相关的广泛的表型异常与罕见的单核苷酸（SNP）ORETERION和DELETIN-IRFINB（IRF）（IRF）（IRF）（IRF）（IRF）（IRF）（IRF）（IRF）（IRF）（IRF）（IRF）（IRF）（IRF）（IRF）（IRF）（IRF）（IRF）（IRF）（IRF）（IRF）（IRF）（IRF）（IRF）（IRF）（IRF）（IRF）（IRF）（IRF）（IRF）（IRF）（IRF）（IRF）（IRF）（IRF）（IRF）（IRF）（IRF）综合体内。到目前为止，已经通过整个外显子组测序鉴定了34例患者，这些测序携带不同的杂合致病变体，跨越了蛋白质C-末端的N末端的第一个聚谷氨酰胺道跨越无孔基因的无源基因。结果，患者的表型谱是高度异质性的，从异常的神经认知发展到具有发育和癫痫相关的脑病的严重神经退行性课程。虽然与IRF2BPL相关疾病的治疗旨在通过有症状的多学科管理来减轻患者的症状，但没有完全缓解个别患者症状的前景。Yet, the recent advancement of CRISPR-Cas9-derived gene editing tools, leading to the generation of base editors (BEs) and prime editors (PEs), provide an encouraging new therapeutic avenue for treating NEDAMSS and other neurodevelopmental and neurodegenerative diseases, which contain SNPs or smaller Indels in post- mitotic cell populations of the central nervous system, due to its ability to generate site-specific DNA序列修饰而不会产生双重断裂，并募集非同源DNA末端连接修复机制。
Tempus 综合治疗选择
xT CDx 是一种基于定性下一代测序 (NGS) 的体外诊断设备，旨在用于检测 648 个基因中的替换（单核苷酸变异 (SNV) 和多核苷酸变异 (MNV)）和插入和缺失变异 (INDEL)，以及微卫星不稳定性 (MSI) 状态，使用从福尔马林固定石蜡包埋 (FFPE) 肿瘤组织标本中分离的 DNA，以及从匹配的正常血液或唾液标本中分离的 DNA，这些标本来自先前诊断为实体恶性肿瘤的癌症患者。该测试旨在作为伴随诊断 (CDx)，以根据批准的治疗产品标签识别可能从伴随诊断适应症表中列出的靶向治疗中受益的患者。此外，xT CDx 旨在提供肿瘤突变分析，供合格的医疗保健专业人员根据肿瘤学专业指南对先前诊断为实体恶性肿瘤的患者使用。除了伴随诊断指征表中列出的基因发现之外，其他基因组发现对于任何特定治疗产品的标示用途都不是规定性的或决定性的。xT CDx 是在伊利诺伊州芝加哥的 Tempus Labs, Inc. 进行的单点检测。如需完整的 xT CDx 标签，包括伴随诊断指征和重要风险信息，请访问 tempus.com/xt-cdx-label/