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ErCas12a CRISPR-MAD7 用于人类细胞、小鼠和大鼠的模型生成
摘要 MAD7 是从直肠真杆菌中分离出来的一种工程化的 2 类 VA 型 CRISPR-Cas (Cas12a/Cpf1) 系统。与 Cas9 类似，它是一种 RNA 引导的核酸酶，在大肠杆菌和酵母细胞中具有基因编辑活性。本文报告称，MAD7 能够分别在人类 HCT116 和 U2OS 癌细胞系中产生内源基因的插入/缺失和荧光基因标记。此外，MAD7 非常擅长在小鼠和大鼠胚胎中产生插入/缺失、小 DNA 插入（23 个碱基）和 1 至 14 kb 大小的较大整合，从而产生活产转基因动物。由于不同的原间隔区相邻基序要求、小引导 RNA 和高效的靶向基因破坏和插入，MAD7 可以扩展 CRISPR 工具箱，用于跨不同系统和模型生物进行基因组工程。
垂直农业：从基因改造到环境改造
该系统具有通用性，为以有用的效率引入点突变和小插入/缺失提供了几乎无限的可能性，而无需共同传递修复模板。该系统的进一步改进应侧重于提高主要编辑效率，主要通过测试不同的 RT 和 pegRNA 设计。为了克服编辑窗口的限制，使用具有不同 PAM 要求的不同 Cas 蛋白将允许将复合物带到正确的位置以引入所需的修改。此外，需要详细分析该技术在植物中的特异性，并与其他可用的植物基因组修饰方法在脱靶编辑方面进行比较分析。最后，为了提高主要编辑技术的多功能性，有必要改进引入的插入/缺失的大小并减少编辑副产物。
数字液滴 PCR 和 IDAA 用于检测疟疾物种斯氏按蚊中的 CRISPR 插入/缺失编辑
摘要 CRISPR/Cas9 技术是设计基因驱动系统以控制和/或改变蚊媒种群的有力工具；然而，CRISPR/Cas9 介导的非同源末端连接突变可能对产生抗驱动的等位基因产生重要影响，从而对驱动效率产生重要影响。我们展示并比较了两种技术在疟疾媒介蚊子斯氏按蚊中的插入或缺失 (indel) 检测能力：扩增子分析插入缺失检测 (IDAA™) 和液滴数字™ PCR (ddPCR™)。这两种技术在含有不同比例和不同大小的插入缺失的蚊子样本中都显示出插入缺失频率的准确性和可重复性。此外，这些技术具有优势，使它们可能更适合在基因驱动蚊子的笼养试验和封闭式现场测试中进行高通量非同源末端连接分析。
对改变转录因子间距的自然插入和缺失的系统分析可识别耐受性和敏感的转录
基因表达的抽象调节需要在启动子和增强子上对序列特异性转录因子（TFS）的联合结合。先前的研究表明，TF结合位点之间间距的改变会影响启动子和增强子活性。然而，由于自然发生的插入和删除（Indels）导致的TF间距改变的重要性尚未系统地分析。为了解决这个问题，我们首先表征了通过ChIP-Seq（Chro-Matin免疫沉淀测序）确定的人类K562细胞中73 TF的全基因组间距关系。我们发现了协作因素之间放松的间距的主要模式，其中包括45个TFS专门与其结合伴侣展示了放松的间距。接下来，我们利用了遗传多样的小鼠菌株和人个体提供的数百万个indels来研究间距改变对TF结合和局部组蛋白乙酰化的影响。这些分析表明，与直接影响TF结合位点的遗传变异相比，通常可以容忍自然存在的插入的间距改变。为了实验验证这一预测，我们在巨噬细胞系中的六个内源基因组基因座上引入了PU.1和C/EBPβ结合位点之间的合成间距改变。在这些位置，PU.1和C/EBPβ的合作结合明显，可耐受的间距的变化范围从5 bp增加到> 30 bp的降低。总的来说，这些发现对理解增强子选择的机制以及对非编码遗传变异的解释具有影响。
删除吗啉结合位点 (DeMOBS) 来评估变体表型的特异性
两种互补方法被广泛用于研究斑马鱼的基因功能：诱导基因突变（通常使用靶向核酸酶，例如 CRISPR/Cas9）和抑制基因表达（通常使用吗啉寡聚体）。这两种方法都不完美。吗啉 (MO) 有时会产生脱靶或毒性相关效应，这些效应可能会被误认为是真正的表型。相反，基因突变体可能会受到补偿，或者由于泄漏（例如使用隐蔽剪接位点或下游 AUG）而无法产生无效表型。当观察到突变体和吗啉诱导的（变形）表型之间的差异时，对此类表型的实验验证将变得非常耗费人力。我们已经开发出一种简单的遗传方法来区分真正的变形表型和由于脱靶效应而产生的表型。我们推测 5′ 非翻译区内的插入/缺失不太可能对基因表达产生显着的负面影响。在 MO 靶位点内诱发的突变将产生吗啉代折射等位基因，从而抑制真正的 MO 表型，同时保留非特异性表型。我们在具有独有合子功能的基因 tbx5a 和具有强烈母体效应的基因 ctnnb2 上测试了这一假设。我们发现吗啉代结合位点内的插入/缺失确实能够抑制合子和母体形态表型。我们还观察到，此类插入/缺失抑制吗啉代表型的能力确实取决于缺失的大小和位置。尽管如此，使母体和合子基因中的吗啉代结合位点发生突变可以确定形态表型的特异性。
捕获途径 - 口腔学 - 触觉 - 直通...
虽然核分型，鱼类，RT-PCR和微阵列是检测融合基因的常规研究技术，但它们都有局限性。随着基于NGS的方法的改进，DNA和RNA测序迅速成为选择方法。ngs面板促进了同时发现新的变化，以及已知的突变以及基因组研究的结构改变。这种突变检测能力的发展快速增长已超越SNV和Indels，现在包括易位。
利用 CRISPR/Cas9 改造的麦胶蛋白基因家族
摘要：小麦的 α -麦胶蛋白与其他面筋成分一起决定了面包的粘弹性。然而，它们也与人类病理有关，如乳糜泻或非乳糜泻小麦敏感性。CRISPR/Cas 已成功用于敲除面包小麦和硬粒小麦中的 α -麦胶蛋白基因，从而获得低筋小麦品系。尽管如此，这些基因的突变分析很复杂，因为它们在 A、B 和 D 亚基因组中呈现多个高度同源的拷贝串联排列。在这项工作中，我们提出了一种基于 NGS 扩增子测序的生物信息学流程，用于分析两个单向导 RNA (sgRNA) 靶向的 α -麦胶蛋白基因中的插入和缺失 (InDels)。通过与最相似的野生型亲本序列进行比较，该方法可以识别突变的扩增子并分析 InDels。对样本间比较进行了 TMM 标准化；能够研究各代中每个 InDel 的丰度，并观察 Cas9 编码序列在不同细胞系中分离的影响。该工作流程的实用性与识别可能的基因组重排（例如由于 Cas9 切割活性而导致的大量缺失）有关。该流程能够快速表征多拷贝基因家族中多个样本的突变。
基础编辑纠正常见的salla病slc17a5 c.115c> t变体
自由唾液酸储存障碍（FSASD）是由SLC17A5基因的病原体变异引起的，该基因编码了lyso- somal跨膜蛋白sialin。sialin的损失或缺乏效率会损害FSA从溶酶体中传输，导致细胞功能障碍和神经系统障碍，最严重的FSASD形式导致童年时期死亡。目前尚无FSASD的疗法。在这里，我们评估了针对创始人变体的CRISPR-CAS9介导的定向修复（HDR）和腺嘌呤基础编辑（ABE）SLC17A5 C.115C> t（P.Arg39cys）在人类皮肤上的效果。We observed min- imal correction of the pathogenic variant in HDR samples with a high frequency of undesired insertions/deletions (indels) and signi fi cant levels of correction for ABE-treated samples with no detectable indels, supporting previous work showing that CRISPR-Cas9-mediated ABE outperforms HDR.此外，ABE治疗纯合或复合杂合子SLC17A5 c.115c> t人类皮肤纤维细胞降低了FSA的显着减少，以支持疾病病理学的改善。将这种安倍策略转换为携带slc17a5 c.115c> t变体的小鼠胚胎纤维细胞概括了这些结果。我们的研究将基础编辑作为FSASD变体SLC17A5 c.115c> t的治疗方法的可行性，并突出了基础编辑在单基因疾病中的实用性，而单基膜蛋白功能受损。
M.S.教授Swaminathan：印度绿色革命之父
DNA修复机制，例如非同源末端连接。此断裂的自发修复会导致突变导致基因沉默，基因敲除或基因活性的变化。生产的SDN-1基因组编辑植物将不含外源/外源DNA。这些突变可以是基础替代/indels/删除，包括大删除或结构变化。这些结果突变与自然界中发生的突变相当，该突变是通过常规诱变治疗或在原始/次级基因库中发现的自然变异获得的。
将个性化药物带到新的水平
BostonGene achieves the most comprehensive overview of a tumor through whole exome (WES) and transcriptome (RNAseq) sequencing to detect genomic alterations such as fusions, single nucleotide variants (SNV), indels, copy number alterations (CNA), tumor mutational burden (TMB), microsatellite instability (MSI), fusions, frameshifts,超过20,000个基因的重排和表达水平。Bostongene肿瘤肖像™测试结合了精确的数据处理和专有算法，以生成易于理解的肿瘤示意图，即分子功能肖像*。