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最初发表于：Saha, Aakash;阿兰特斯（Paul R）；许罗海恩 V； Narkhede，Yogesh B；吉内克，马丁；巴勒莫，朱莉娅（2020 年）。分子动力学
摘要：CRISPR-Cas12a 是一种基因组编辑系统，最近也被用于核酸检测，有望通过 DETECTR 技术诊断 SARS-CoV-2 冠状病毒。在这里，多微秒分子动力学的集合表征了允许 CRISPR-Cas12a 中进行核酸处理的关键动态决定因素。我们表明，DNA 结合会诱导 Cas12a 构象动力学的转换，从而激活外周 REC2 和 Nuc 结构域以使核酸能够裂解。模拟表明，Nuc 结构域的大振幅运动可能有利于系统向 DNA 裂解的构象激活。在这个过程中，REC 叶起着关键作用。因此，REC 和 Nuc 的联合动力学显示出引发 DNA 靶链向催化位点构象转变的趋势。最值得注意的是，REC2 区域和 Nuc 结构域的高度耦合动力学表明 REC2 可以充当 Nuc 功能的调节器，类似于之前在 CRISPR 相关核酸酶 Cas9 中的 HNH 结构域中观察到的情况。这些相互的结构域动力学可能对于 DNA 的非特异性结合至关重要，从而对于 DETECTR 技术的潜在机制功能至关重要。考虑到 REC 是系统特异性的关键决定因素，我们的发现为未来旨在表征其在 CRISPR-Cas12a 中的功能的生物物理研究提供了合理基础。总体而言，我们的成果推进了我们对 CRISPR-Cas12a 机制的理解，并为改进基因组编辑和病毒检测的新工程努力提供了依据。■ 简介
CRISPR/CAS 技术：基因编辑的一场革命
科学进步通常以重大技术突破为特征。单克隆抗体的产生、聚合酶链式反应 (PCR) 的发明或荧光蛋白的使用对生命科学产生了巨大影响。DNA 编辑技术已被广泛用于以特定且受控的方式修改基因。例如，在 CRISPR/Cas 技术 (Jinek 等人，2012) 开发之前，插入基因的额外副本 (转基因) 或通过同源重组破坏或替换基因是使用的基因组修饰方法。1993 年 CRISPR 序列的表征 (Mojica 等人，1993) 以及随后基因修饰技术的开发 (Jinek 等人，2012，Gasiunas 等人，2012) 彻底改变了现代生物学中遗传实验的格局。
基因组编辑引起的植物的未知可能性 - 零发射
1）Abe F.等。（2019）基因组编辑的三重衰退突变改变了小麦的种子休眠状态。细胞报告28，1362-1369。2）Cong L.等。（2013）使用CRISPR/CAS9系统的多重基因组工程。科学339，819-823。3）Ito Y.等。（2017）RIN突变的重新进化和RIN在诱导番茄成熟诱导中的作用。自然工厂3，866-874。4）Jinek M.等。（2012）适应性细菌免疫中可编程的双RNA引导的DNA核酸内切酶。科学337，816-821。5）Jinek M.等。（2013）人类细胞中的RNA编程基因组编辑。Elife 2，E00471。6）Mali P.等。（2013）通过CAS9通过RNA引导的人类基因组工程。科学339，823-826。7）Yasumoto S.等。（2020）通过农业感染通过短暂的talen表达在四倍体马铃薯中靶向基因组编辑。植物生物技术37，205-211。
CRISPR系统在灵敏核苷酸检测中的拓展开发与应用
CRISPR/Cas 系统最初是作为基因编辑工具开发的，在核苷酸检测方面也显示出巨大的潜力。最近发表在 Molecular Cell 上的一项研究（Freije et al., 2019）开发了一种基于 Cas13a 的 CARVER（Cas13 辅助限制病毒表达和读取）来检测 RNA 病毒，例如淋巴细胞脉络丛脑膜炎、甲型流感和水泡性口炎，这为在疾病诊断中检测广泛的病毒核苷酸提供了潜在的扩展应用。细菌和古细菌利用 CRISPR/Cas（成簇的规律间隔的短回文重复序列/CRISPR 相关）系统作为适应性免疫系统来防御噬菌体感染。 Cas效应子在CRISPR RNA（crRNA）的引导下，结合并切割DNA或RNA靶标，以防御入侵的核苷酸（Horvath and Barrangou，2010；Sorek et al.，2013；Barrangou and Marafini，2014）。CRISPR/Cas系统的发现可以追溯到1987年，规则间隔的直向重复序列首次在大肠杆菌的iap基因中发现（Ishino et al.，1987）。直到2002年，间隔直向重复序列被命名为CRISPR（Jansen et al.，2002）。2012年，Jinek et al.报道称，CRISPR/Cas9 可以用单个 RNA 嵌合体特异性切割靶 DNA（Jinek 等，2012），拉开了 CRISPR/Cas9 系统用于基因组编辑的序幕。自 CRISPR/Cas9 被发现以来，CRISPR/Cas 系统备受关注，CRISPR 工具箱不断扩充。作为 DNA 靶向 CRISPR 工具箱的有力补充，CRISPR/Cas12a（以前称为 CpfI）是一种 2 类 V 型 CRISPR/Cas 效应物（Zetsche 等，2015），具有
crispr/cas9技术应用于改进...
3 Sanger。 F.，库尔森，AR。 «通过与DNA聚合酶启动合成来确定DNA中序列的快速方法。 J mol Biol。 1975;第25卷； 94（3）：441–448。 4科学历史研究所。 [publupaciónenLínea]«re-Combinant-DNA（rDNA）技术»。 2017。 [Consulta：15/04/2019]。 5 Shampo，M.A。;凯尔（R. A.） «Kary B. Mullis，诺贝尔奖获得者，用于复制DNA»。 诉讼梅奥诊所。 2001;卷。 77：606。 6 Jinek，M.，Chylinski，K.，Fonfara，I.，Hauer，M.，Doudna，J. E. 科学。 2012;卷。 337，（6096）：816–821。 7张，F。«使用CRISPR/CAS系统的多重基因组工程»。 科学。 2013;卷。 339，n。 6121：819-823。 8 Wang，H.，Yang，H.，Shivalila，C.，Dawlaty，M.，Cheng，A.，Zhang，F。，＆Jaenisch，R。««由CRIS/CASPR/CASPR/CASPR/CAS介导的基因组启动中的多个基因中携带突变的小鼠的一步一代。 单元格。 2014; 153（4）：910-918。3 Sanger。F.，库尔森，AR。«通过与DNA聚合酶启动合成来确定DNA中序列的快速方法。J mol Biol。1975;第25卷； 94（3）：441–448。4科学历史研究所。[publupaciónenLínea]«re-Combinant-DNA（rDNA）技术»。2017。[Consulta：15/04/2019]。5 Shampo，M.A。;凯尔（R. A.） «Kary B. Mullis，诺贝尔奖获得者，用于复制DNA»。 诉讼梅奥诊所。 2001;卷。 77：606。 6 Jinek，M.，Chylinski，K.，Fonfara，I.，Hauer，M.，Doudna，J. E. 科学。 2012;卷。 337，（6096）：816–821。 7张，F。«使用CRISPR/CAS系统的多重基因组工程»。 科学。 2013;卷。 339，n。 6121：819-823。 8 Wang，H.，Yang，H.，Shivalila，C.，Dawlaty，M.，Cheng，A.，Zhang，F。，＆Jaenisch，R。««由CRIS/CASPR/CASPR/CASPR/CAS介导的基因组启动中的多个基因中携带突变的小鼠的一步一代。 单元格。 2014; 153（4）：910-918。5 Shampo，M.A。;凯尔（R. A.）«Kary B. Mullis，诺贝尔奖获得者，用于复制DNA»。诉讼梅奥诊所。2001;卷。 77：606。 6 Jinek，M.，Chylinski，K.，Fonfara，I.，Hauer，M.，Doudna，J. E. 科学。 2012;卷。 337，（6096）：816–821。 7张，F。«使用CRISPR/CAS系统的多重基因组工程»。 科学。 2013;卷。 339，n。 6121：819-823。 8 Wang，H.，Yang，H.，Shivalila，C.，Dawlaty，M.，Cheng，A.，Zhang，F。，＆Jaenisch，R。««由CRIS/CASPR/CASPR/CASPR/CAS介导的基因组启动中的多个基因中携带突变的小鼠的一步一代。 单元格。 2014; 153（4）：910-918。2001;卷。77：606。6 Jinek，M.，Chylinski，K.，Fonfara，I.，Hauer，M.，Doudna，J.E.科学。2012;卷。337，（6096）：816–821。7张，F。«使用CRISPR/CAS系统的多重基因组工程»。科学。2013;卷。339，n。 6121：819-823。8 Wang，H.，Yang，H.，Shivalila，C.，Dawlaty，M.，Cheng，A.，Zhang，F。，＆Jaenisch，R。««由CRIS/CASPR/CASPR/CASPR/CAS介导的基因组启动中的多个基因中携带突变的小鼠的一步一代。单元格。2014; 153（4）：910-918。
在具有基础编辑的植物中精确且可预测的基因组编辑
自1996年第一个站点定向的核酸酶（SDN）和锌指核酸酶（ZFN）的发展以来，基因组编辑场发生了迅速变化（Kim等，1996）。自此以来，已经开发了许多工具，可以实现遗传序列的目标变化，最广泛使用的是CRISPR/CAS9（Jinek等，2012）。SDN允许研究人员轻松地靶向基因组中的序列，并在包括植物在内的各种生物体中以非常特定的方式引入变化（Feng等，2013）。SDNS的使用导致自引入以来的短时间内在植物中产生了各种各样的新表型。早期基因组编辑的重点主要是在基因敲除上，这很容易通过靶向核酸酶实现。SDNS形成双链断裂（DSB），由主机的本机维修机械修复。这通常会导致返回原始基因组序列，或插入或删除
用于基因组编辑的 Cas9 核糖核蛋白的制备
通过递送预组装的 Cas9 核糖核蛋白 (Cas9 RNP) 进行基因组编辑是一种越来越流行的方法，适用于难以通过传统质粒和病毒方法进行遗传操作的细胞类型。Cas9 RNP 编辑稳健、精确、能够多路复用且不含遗传物质。它在细胞中的短暂存在限制了残留的编辑活性。该方案描述了通过异源表达和从大肠杆菌纯化来制备重组化脓性链球菌 Cas9 (SpCas9) 蛋白，以及通过体外转录和 PAGE 纯化合成 CRISPR 向导 RNA。SpCas9 是第一个发现的 CRISPR Cas9（Jinek 等人，2012 年），也是基因组编辑应用中最典型的 Cas 酶之一。使用这种 Cas9 RNP 配方，我们已证明通过电穿孔在原代人类 T 细胞和自然杀伤 (NK) 细胞中以及通过聚乙二醇介导的转化在真菌和植物中实现了高效的基因组编辑。我们的 Cas9 RNP 制备协议是一致且简单的，可用于其他细胞类型和生物体的基因组编辑。
人类基因组中的伦理争议和挑战...
1993年弗朗西斯科·莫吉卡（Francisco Mojica）等。1,5）发现了现在被称为“定期散布短的短质体重复的群集”（CRISPR）。Jinek等。 2,5）在2012年将CRRNA和曲克纳分子组合成单个RNA的唯一分子。 通过Crisper-Cas9系统3,5）促进了哺乳动物细胞中成功的基因组编辑。 在人类基因组中，该系统在2013年3 - 5年成功重复。 Liang等。 6）2015年宣布，CRISPR-CAS9基因编辑技术用于首次修改人类胚胎的DNA序列6,7）。 CRISPR-CAS9已成为人类工程领域的游戏规则改变者8,9）。 该系统具有卓越的功效，优越的安全性，更精确，受欢迎，具有经济利益，并且很容易获得获得结果。 该技术使用酶7）而不是病毒来改变DNA。 随着CRISPR-CAS9的利用迅速增加，它为基因编辑带来了高水平的破坏8-12）研究和伦理格局。 关注，争议和挑战在人类基因组编辑中的整个道德格局中产生。Jinek等。2,5）在2012年将CRRNA和曲克纳分子组合成单个RNA的唯一分子。通过Crisper-Cas9系统3,5）促进了哺乳动物细胞中成功的基因组编辑。在人类基因组中，该系统在2013年3 - 5年成功重复。Liang等。 6）2015年宣布，CRISPR-CAS9基因编辑技术用于首次修改人类胚胎的DNA序列6,7）。 CRISPR-CAS9已成为人类工程领域的游戏规则改变者8,9）。 该系统具有卓越的功效，优越的安全性，更精确，受欢迎，具有经济利益，并且很容易获得获得结果。 该技术使用酶7）而不是病毒来改变DNA。 随着CRISPR-CAS9的利用迅速增加，它为基因编辑带来了高水平的破坏8-12）研究和伦理格局。 关注，争议和挑战在人类基因组编辑中的整个道德格局中产生。Liang等。6）2015年宣布，CRISPR-CAS9基因编辑技术用于首次修改人类胚胎的DNA序列6,7）。CRISPR-CAS9已成为人类工程领域的游戏规则改变者8,9）。该系统具有卓越的功效，优越的安全性，更精确，受欢迎，具有经济利益，并且很容易获得获得结果。该技术使用酶7）而不是病毒来改变DNA。随着CRISPR-CAS9的利用迅速增加，它为基因编辑带来了高水平的破坏8-12）研究和伦理格局。关注，争议和挑战在人类基因组编辑中的整个道德格局中产生。
piggyPrime：人类细胞中的高效 Prime 编辑......
基于 CRISPR-Cas9 系统的 Prime Editing（Jinek 等人，2012 年；Jinek 等人，2013 年；Ran 等人，2013 年）通过支持有针对性的插入、删除或 12 种可能的单碱基替换中的任何一种，实现基因组的精确编辑。通过 Prime Editing 进行的基因编辑既不涉及供体模板，也不涉及双链断裂（Anzalone 等人，2019 年）。Prime Editing 的这些独特属性基于 Prime Editor (PE) 的传递，该 Prime Editor 由 Cas9-逆转录酶融合蛋白（以下称为 PE2）以及 Prime Editing 向导 RNA（pegRNA）组成，后者指定基因组靶标以及要直接写入基因组的所需编辑。 Prime 编辑在治疗致病突变以及生成疾病模型（体外和体内）方面具有巨大潜力（Schene 等人，2020 年；Jang 等人，2021 年；Kim 等人，2021 年；Liu 等人，2021 年；Park 等人，2021 年；Petri 等人，2021 年；Qian 等人，2021 年）。然而，目前 Prime 编辑的使用受到低效率的挑战，导致需要耗费大量的优化和/或筛选方法才能实现令人满意的编辑效果（Liu 等人，2020 年；Schene 等人，2020 年；Chemello 等人，2021 年；Kim 等人，2021 年；Petri 等人，2021 年）。将编码传统 CRISPR 效应物（如 Cas9 和单向导 RNA）的基因盒稳定整合到哺乳动物细胞基因组中，已广泛应用于生命科学研究，包括用于生成模型细胞系和 CRISPR 筛选（Shalem 等人，2014 年；Holmgaard 等人，2017 年；Thomsen 等人，2020 年）。对于主要编辑，由于 PE2 编码序列较大（6351 bp），因此难以将 PE2 表达盒有效整合到哺乳动物细胞基因组中。由于包装能力有限，这使病毒载体的使用变得困难（Kumar 等人，2001 年），到目前为止，PE2 系统仅通过使用两个独立的慢病毒载体递送内含肽分裂 PE2 盒而整合到哺乳动物细胞基因组中（Anzalone 等人，2019 年）。这里我们介绍了 piggyPrime，这是一种非病毒单载体系统，可利用 piggyBac 转座子系统的强大整合能力，轻松高效地将所有主要编辑组件整合到人类细胞中。重要的是，DNA 转座促进的 PE2 和 pegRNA 的长期表达支持提高主要编辑水平，从而为有效转基因提供了一种新方法。
引用：Yang，W.，Qi，W.，Li，Y.，Wang，J.，Luo，Y.，Ding，D.，Mo，S.，Chen，B.，Lu，Y. （2021）。编程的顺序切割endows
CRISPR/CAS9介导的基因组编辑技术引发了生物学研究的革命（Jinek等，2012）。cas9与指南RNA在精确的位置上切割DNA，并通过包括动物和植物在内的高层真核细胞中的非同源末端连接（NHEJ）途径有效地修复所得的双链断裂（DSB）。由于NHEJ的维修过程是容易出错的，因此结果结果主要是框架之外的事件。因此，CAS9主要被认为是一种高度效力的“敲除”工具，并深深地认为无法在没有重大修改的情况下形成框架基础转换。结果，框架内的基础变化必须依赖于脱氨酶介导的基础编辑器（Komor等，2016; Gaudelli等，2017），主要编辑工具（Anzalone等，2019）或通过同源指导性维修或NHEJ通过供体DNA模板的低效率融合。最近，越来越多的证据表明，NHEJ修复结果是非随机且可预测的（Shen等，2018； Allen等，2018； Chen等，2019）。的确，众所周知，即使在同一切割部位， +1/–1 bp indels也常常主导NHEJ修复结果。我们突然意识到