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植物基因组编辑面临的巨大挑战
世界依赖农业，而农业本身也面临着巨大的挑战，例如满足不断增长的人口对食物、纤维和生物能源的需求。必须利用不断减少的可耕地面积来满足这些需求，同时还要适应导致洪水、干旱和高温更频繁的气候变化，以及培育能够抵抗疾病和害虫且几乎不使用有害环境的化学物质的农作物。所有这些挑战都需要创新的解决方案，这些解决方案将源自植物科学和农业领域的基础和应用研究，包括基因组编辑。基因组编辑是指实现精确的基因组修改，例如在细胞或生物体中对 DNA 进行位点特异性插入、删除、替换和表位等位基因改变。基因组编辑基本上是基于体内 DNA 双链断裂 (DSB)，这种断裂是由经过编程以识别预选基因组位点的工程内切酶诱导的，并利用细胞 DSB 修复机制 (Carroll, 2014)。可编程核酸酶包括巨核酸酶（ Gong 和 Golic，2003 年）、锌指核酸酶 (ZFN)（Urnov 等人，2005 年）、转录激活因子样效应核酸酶 (TALEN)（Christian 等人，2010 年；Li 等人，2011 年）和成簇的规律间隔的短回文重复序列 (CRISPR) 相关核酸酶 (Cas)（Jinek 等人，2012 年；Cong 等人，2013 年；Mali 等人，2013 年）。此外，工程化核酸酶变体可以在没有 DSB 的情况下进行基因组编辑（例如，通过引起 DNA 单链断裂）（Rees and Liu，2018 年）或表观基因组编辑（完全没有 DNA 断裂，也没有 DSB 修复）（Holtzman and Gersbach，2018 年）。基因组编辑已成为最重要的生物技术工具，它促进了我们的生物学知识和生物技术领域本身的增长，并做出了巨大贡献，推动了工业、医学和农业的快速发展。在过去的 10 年中，我们目睹了基于 CRISPR 的基因组编辑技术的快速发展及其在植物功能基因组学和作物改良等各个领域的应用。植物中的基因组编辑技术包括序列特异性核酸酶的工程设计、编辑试剂的递送、编辑事件的产生和选择以及完整植物的表征和利用，这对公众接受基因组编辑植物和监管部门的批准具有进一步的影响。在过去的十年中，基因组编辑平台已经建立并应用于 45 多个植物属（Shan et al.，2020）。然而，为了更好地理解基因组编辑的分子和遗传机制、持续改进和植物中基因组编辑技术的新应用，仍然需要进行大量的研究工作。具体而言，植物基因组编辑面临如下主要挑战。
利用CRISPR/Cas9进行基因组编辑的原理与过敏性疾病......
生物化学研究 2008 ： 63 ： 17 ― 20. 5) Carroll D. 利用可靶向核酸酶进行基因组工程。生物化学年鉴2014； 83：409―39.6）Jinek M、Chylinski K、Fonfara I、Hauer M、Doudna JA、Charpentier E. 适应性细菌免疫中的可编程双RNA引导DNA内切酶。科学 2012； 337：816―21.7）Gasiunas G、Barrangou R、Horvath P、Siksnys V. Cas9-crRNA 核糖核蛋白复合物介导特异性 DNA 切割以实现细菌适应性免疫。美国国家科学院院刊2012； 109：E2579―86. 8) Nakata A，Shinagawa H，Amemura M.大肠杆菌碱性磷酸酶同工酶基因（iap）的克隆。基因 1982； 19: 313 -- 9. 9) Nakata A、Amemura M、Makino K. 大肠杆菌 K-12 染色体中重复序列的异常核苷酸排列。细菌学杂志1989； 171: 3553 ― 6.10) Groenen PM、Bunschoten AE、van Soolingen D、van Embden JD。结核分枝杆菌直接重复簇中 DNA 多态性的性质；通过一种新颖的分型方法进行菌株鉴别的应用。分子微生物学1993； 10： 1057 — 65。11) Mojica FJ、Judge G、Rodriguez-Valera F. 不同盐度下邻近部分修饰的 PstI 位点的 Haloferax medi- terranei 序列的转录。分子微生物学1993； 9：613―21。12）Bult CJ，White O，Olsen GJ，Zhou L，Fleischmann RD，Sutton GG 等。产甲烷古菌 Methanococcus jannaschii 的完整基因组序列。科学 1996 ； 273: 1058 ― 73.13) Haft DH，Selengut J，Mongodin EF，Nelson KE。原核生物基因组中存在 45 个 CRISPR 相关 (Cas) 蛋白家族和多种 CRISPR/Cas 亚型。 PLoS Comput Biol 2005； 1：e6 14) Makarova KS、Aravind L、Grishin NV、Rogozin IB、Koonin EV。通过基因组背景分析预测的嗜热古菌和细菌特有的 DNA 修复系统。核酸研究2002； 30：482―96.15）Makarova KS，Aravind L，Wolf YI，Koonin EV。 Cas 蛋白家族的统一以及 CRISPR-Cas 系统起源和进化的简单场景。直接生物学2011； 6：38。16) Mojica FJM、Ten-Villaseñor C、Garcia-Martinez J、Soria E. 间隔规则的原核重复序列的介入序列源自外来遗传元素。 J Mol Evol.2005； 60： 174 ― 82。17) Pourcel C、Salvignol G、Vergnaud G. 鼠疫耶尔森氏菌中的 CRISPR 元素通过优先吸收噬菌体 DNA 获得新的重复序列。微生物学 2005； 151: 653 ― 63.18) Bolotin A, Quinquis B, Sorokin A, Ehrlich SD。
使用农杆菌介导的转化技术的CRISPR编辑的桦木植物无DNA整合
摘要39 CRISPR/CAS9系统已成为基因组编辑中的强大工具；但是，40代CRISPR编辑的无DNA植物仍然具有挑战性。在这项研究中，使用了使用农业介导的转化43（CPDAT方法），使用41个Betula Plathylla（Birch）构建一种生成CRISPR PRECTER 42植物的方法。该技术利用瞬时遗传转化将TNNA编码GRNA和Cas9引入桦木细胞，T-DNA将表达45个合成的GRNA和CAS9蛋白，这将形成一个复合物以裂解靶标46 DNA位点。基因组可能由于DNA修复而被突变，并且这些突变将被保留47个，并积累不取决于是否将T-DNA整合到48个基因组中。瞬时转化后，将桦树植物切成植物，至49个诱导不定的芽而没有抗生素选择压力。每个不定的芽50可以视为突变51检测的独立潜在的CRISPR编辑线。CRISPR编辑的桦木植物没有外国DNA整合，还可以通过筛选CRISPR编辑的线条而没有T-DNA整合。在65 53个随机选择的独立线中，突变率为80.00％，包括40.00％54的线，两个等位基因突变。此外，在有65条研究的线（7.69％）中，有5条线是CRISPR-编辑的桦木植物，而没有DNA整合。总而言之，这56种创新方法提出了一种生成CRISPR编辑的桦木57种植物的新型策略，从而显着提高了产生常见的58种CRISPR-CRISPR-编辑植物的效率。81这些发现提供了开发植物59基因组编辑技术的巨大潜力。60 61简介62 CRISPR/CAS9是一种适用于植物育种的强大而有效的基因编辑技术，63可以精确有效地修饰基因组（Fidan等，2023）。CRISPR/CAS 64系统最初被发现可以识别并裂解入侵的病毒或噬菌体的65个DNA，可作为细菌中的免疫系统（Ahmad，2023; Kim等，2016; 66 Komor等，2016; Koonin等，2017; Zetsche等，2015; 66 Komor et al。，2015;CRISPR-CAS系统67已根据其CRISPR-CAS位点的布置和相关的CAS 69蛋白（Koonin等，2017; Makarova; Makarova and Koonin，2015）分类为两个主要类（II，II，III，68 IV，V和VI）和各种类型（I，II，III，68 IV，V和VI）。两个主要类是70类1和2，根据其利用的CRISPR 71 RNA（CRRNA）摄影蛋白的复合物（McDonald等，2019）。1类系统（包括72型I，III和IV）由由几种CAS 73蛋白结合的成熟CRRNA组成，形成了巨大的蛋白质复合物。该复合物通过在原始探针75的互补链DNA（靶位点）和GRNA间隔者的5'-End序列之间进行配对，作为目标74 DNA位点的指南，并且具有核酸酶76的活性，以裂解靶向序列（Garneau，2010; Tiwari等，2010; Tiwari et and and and an。2类系统包括II型，V和VI，分别具有78个CAS蛋白，例如Cas9，Cas12或Cas13，并且还具有靶向和切割DNA的79功能（Jinek等，2012）。在2类系统中，80 Cas9-Crispr系统已被广泛应用。