摘要:通过细胞内递送核苷修饰的mRNA向免疫细胞进行免疫调节是一种有吸引力的体内免疫工程学方法,并在传染病,癌症免疫疗法及其他地区应用。脂质纳米颗粒(LNP)已成为一个有前途的核酸输送平台,但LNP设计标准的定义较差,从而使LNP发现筛选过程的限制限制步骤。在这项研究中,我们采用了基于分子条形码的体内LNP筛查中的高通量,以研究LNP组成对免疫tropismism的影响,并在疫苗和全身免疫疗法中应用。在两个肌内(I.M.)和静脉内(i.v.)注射,我们观察到了两种给药途径的免疫种群对LNP吸收的不同影响,从而了解了对体内免疫工程的LNP设计标准的见解。在验证研究中,I.M.的铅LNP公式 给药显示出比使用临床标准脂质Dlin-MC3-DMA(MC3)配制的LNP的脾脏和排水淋巴结的大量mRNA翻译。 i.v.的铅LNP配方 给药显示出在脾脏和外围血液中的有效免疫转染,其中一个铅LNP显示出脾树突状细胞的大量转染,另一种诱导了循环单核细胞的大量转染。在验证研究中,I.M.的铅LNP公式给药显示出比使用临床标准脂质Dlin-MC3-DMA(MC3)配制的LNP的脾脏和排水淋巴结的大量mRNA翻译。i.v.的铅LNP配方给药显示出在脾脏和外围血液中的有效免疫转染,其中一个铅LNP显示出脾树突状细胞的大量转染,另一种诱导了循环单核细胞的大量转染。总的来说,通过体内高通量筛查确定的免疫型LNP对本地和全身传递的mRNA都表现出显着的希望,并证实了从我们的筛选过程中收集的LNP设计标准的价值,该筛选过程
脂质纳米颗粒(LNP)制剂是一种可靠的基因疗法核酸递送的方法,这是通过全球范围内LNP(基于LNP的RNAi疗法和mRNA疫苗)的推出来体现的。但是,针对特定的组织或细胞仍然是一个主要挑战。LNP给药后,LNP与生物液相互作用(即血液),其成分吸附到LNP表面上,形成了一层被称为“生物分子电晕(BMC)”的生物溶质表面,从而影响LNP稳定性,生物分布和组织和组织曲折。由于ISOALICAGIC介质的ISONAP LNP及其Corona所面临的技术挑战,BMC影响组织和细胞 - 特异性靶向的机制仍然在很大程度上未知。在这项研究中,我们提出了一种新技术,该技术利用磁LNP将LNP – Corona络合物与人血清中存在的未结合蛋白分离。首先,我们开发了一种磁性LNP构造,其中包含> 40个超副磁铁氧化铁纳米颗粒(IONPS)/LNP,所得的含有氧化铁纳米颗粒(IOLNPS)的LNP显示出类似的粒度和形态,因为LNPS载有核酸。我们进一步证明了使用磁分离(MS)系统从未结合蛋白中分离出IOLNP及其相应的BMC。将MS系统中LNP的BMC分布与大小排除柱色谱法进行了比较,并通过质谱法进一步分析,揭示了蛋白质丰度的差异。这种新方法使LNP及其电晕的温和多功能隔离,同时保持其结构完整性。与完整LNP相关的BMC的鉴定提供了对LNP与生物流体相互作用的进一步见解。
脂质纳米粒 (LNP) 是一种新兴的药物制剂,可包覆核酸和蛋白质等生物分子,以及由两者制成的复合物 [ 1 – 3 ]。LNP 呈球形,在电子显微镜下可见。治疗性 LNP 的直径小于 100 纳米,由脂质和核酸等有效载荷组成。LNP 的最初想法源于脂质体,这是一种由磷脂和胆固醇制成的简单得多的脂质囊泡,体积比 LNP 大。脂质体是根据脂质双层理论基于细胞膜建模的。脂质体已用于研究水溶液中脂质的物理化学,并已研究其未来临床用途。为了制备脂质体,通常用旋转蒸发器干燥脂质,悬浮在水溶液中,然后用超声处理以获得呈乳状悬浮液的多层囊泡。现代的 LNP 更加复杂,主要由四种不同的脂质制成(表 1)。LNP 的制备程序可能与这些类似,但根据最近的研究结果进行了优化 [ 4 ]。在 LNP 制备过程中,脂质和 RNA 分别溶解在乙醇和酸性水溶液中。接下来,它们用工业用的自动化微流体设备或研究用的移液器混合。然后,通过透析去除乙醇。在大多数工业应用中,需要进行几种色谱纯化程序来提高最终 LNP 产品的真实性。根据 RNA 包封率、LNP 的直径、其 Zeta 电位和其他生物物理参数来检查最终的 LNP 成分。Zeta 电位表示 LNP 的稳定性。为了优化这些获得的参数,使用多分散性指数 (PDI) 来测量包括 LNP 在内的大分子的异质性;小于 0.1 的值通常被认为是优化条件。在配制 LNP 时,脂质的使用量远远超过 RNA(重量比约为 10:1)。
2 优化合成核酸和蛋白质纳米载体:化学进化方法 ...................................................................................................... 16
由于可电离脂质纳米粒子 (LNP) 在全身给药后主要在肝脏中积累,因此其作为体内核酸递送平台的全部潜力尚未实现,这限制了它们在以肝脏为中心的条件下的成功。用抗体靶向部分对 LNP 进行工程设计可以通过促进位点特异性 LNP 束缚并通过受体介导的内吞作用驱动 LNP 优先吸收到受体表达细胞类型中来实现肝外趋向性。源于胎盘功能障碍的产科疾病,例如先兆子痫,其特征是细胞受体过度表达,包括表皮生长因子受体 (EGFR),这使得靶向 LNP 平台成为妊娠期间胎盘功能障碍的一种令人兴奋的潜在治疗策略。在此,通过对 LNP 进行工程设计,增加抗体功能化的密度,开发了一种 EGFR 抗体偶联的 LNP (aEGFR-LNP) 平台。在永生化胎盘滋养层细胞中体外筛选了 aEGFR- LNP,并在非妊娠和妊娠小鼠体内进行了筛选,并与非靶向配方进行了比较,以将抗体靶向的 mRNA LNP 递送至胎盘。与非靶向对应物相比,我们表现最佳的 LNP 具有中等密度的抗体功能化(1:5 aEGFR-LNP),可介导小鼠胎盘中 mRNA 递送量增加约两倍,EGFR 表达滋养层细胞中 LNP 摄取量增加约两倍。这些结果证明了抗体偶联 LNP 实现肝外向性的潜力,以及 aEGFR-LNP 促进 mRNA 递送至胎盘中 EGFR 表达细胞类型的能力。
摘要 将 mRNA-LNP 有效递送至特定细胞类型仍然是 mRNA 疗法广泛应用过程中面临的主要挑战。传统的靶向方法包括修改脂质组成或对脂质纳米颗粒 (LNP) 的表面进行功能化,这会使制造变得复杂,改变纳米颗粒的大小、电荷和隐身性,影响其递送和免疫原性。在这里,我们提出了一种通用的靶向 mRNA-LNP 递送方法,该方法使用双特异性抗体 (BsAbs) 在 LNP 和细胞表面标志物之间建立桥梁。不是将靶向剂附着到纳米载体上,而是先施用 BsAbs,与靶细胞上的表面蛋白结合,然后将未修饰的 LNP 保留在受影响的组织中。我们证明了在体外和体内将 mRNA-LNP 有效且细胞类型特异性地递送至表皮生长因子受体 (EGFR) 和叶酸水解酶 1 (PSMA) 阳性细胞。该技术的灵活性是通过替换 BsAbs 的细胞靶向区域实现的,从而使得下一代靶向 mRNA 药物能够快速开发。
脂质纳米颗粒的解剖结构 LNP 通常由四种关键成分组成:磷脂、可电离阳离子脂质、胆固醇和聚乙二醇连接 (PEG 化) 脂质(见方框)。与构成每个细胞膜的脂质一样,LNP 包裹并保护其货物。易降解的有效载荷(如 mRNA)受到保护,直到 LNP 能够将其内容物输送到细胞中。LNP 通常是球形的,平均直径在 10 到 1,000 纳米之间,包裹的材料可以包括核酸、蛋白质片段或其他生物有效载荷。人们付出了巨大努力来设计 LNP 组件以与核酸货物兼容。核酸带有多阴离子电荷,这使得它们排斥带负电荷的磷脂。可电离阳离子脂质的开发对于 mRNA-LNP 疫苗至关重要。这些脂质在酸性 pH 下带正电荷,在储存期间包围并包裹核酸。一旦 LNP 被注射并进入 pH 中性的血液,可电离脂质就会恢复中性,这有助于 LNP 逃避免疫检测。颗粒疏水性和正电荷都与免疫反应增强有关。6,7 LNP 通过内吞作用被吸收到细胞中,但它们被隔离在内体中,内体是注定要被破坏的细胞器。然后,可电离脂质在内体的酸性环境中恢复正电荷,最终破坏 LNP 结构并释放细胞内的核酸。8
脂质纳米颗粒 (LNP) 已成为行业中占主导地位的药物输送技术,有望输送 RNA 来上调或下调任何目标蛋白质。LNP 大多通过物理化学靶向技术靶向特定细胞类型或器官,其中 LNP 的脂质组成经过调整以找到具有所需趋向性的混合物。本文研究了肺趋向性 LNP,其器官趋向性源于含有阳离子或可电离脂质,从而赋予正的 zeta 电位。令人惊讶的是,这些 LNP 被发现会诱发大量血栓形成。这种血栓形成出现在肺部和其他器官中,并且研究表明,先前存在的炎症会大大加剧这种血栓形成。这种凝血是由各种含有阳离子脂质的制剂引起的,包括 LNP 和非 LNP 纳米颗粒,甚至是由不具有永久阳离子电荷的肺趋向性可电离脂质引起的。该机制依赖于 LNP 与纤维蛋白原结合并改变其构象,进而激活血小板和凝血酶。基于这些机制,设计了多种解决方案,使带正电荷的 LNP 能够靶向肺部,同时改善血栓形成。这些发现说明了必须尽早研究物理化学靶向方法的风险,并在仔细了解生物机制的情况下重新设计。
摘要脂质纳米颗粒 (LNP) 是临床上最先进的非病毒基因传递系统。虽然在增强传递方面取得了进展,但细胞特异性靶向仍然是一个挑战。靶向部分(例如抗体)可以化学结合到 LNP 上,但是,这种方法很复杂,并且在扩大规模方面面临挑战。在这里,我们开发了一种生成抗体结合 LNP 的方法,该方法利用双特异性抗体 (bsAb) 作为靶向桥。作为 bsAb 的对接位点,我们生成了具有短表位的 LNP,该表位源自血凝素抗原 (HA),嵌入颗粒的 PEG 成分 (LNP HA )。我们生成了 bsAb,其中一个域结合 HA,另一个域结合不同的细胞表面蛋白,包括 PD-L1、CD4、CD5 和 SunTag。bsAb 和 LNP 的非化学结合大大提高了表达同源靶标的细胞的转染效率和特异性。 LNP/bsAb 介导体内转染 PD-L1 表达癌细胞的几率增加 4 倍,体外转染静止原代人 T 细胞的几率增加 26 倍。此外,我们还创建了一种通用 bsAb,可识别 HA 和抗大鼠 IgG2,使 LNP 能够与现成的抗体(如 CD4、CD8、CD20、CD45 和 CD3)结合。通过利用分子对接和 bsAb 技术,这些研究展示了一种简单有效的策略来生成抗体偶联的 LNP,从而实现精确高效的 mRNA 递送。
采用可电离脂质的脂质纳米颗粒 (LNP) 是将 RNA(尤其是 mRNA)递送至细胞的最先进技术。LNP 代表具有明确定义的核心 - 壳颗粒,可有效封装核酸、降低免疫原性和增强功效。虽然人们对 LNP 的结构和活性了解甚多,但对 LNP 摄取、细胞质转移和蛋白质表达的时间关注较少。然而,LNP 动力学是决定递送效率的关键因素。因此,定量了解 LNP 的多级联途径对于阐明递送机制至关重要。在这里,我们回顾了实验以及 LNP 摄取、mRNA 释放和蛋白质表达时间的理论建模。我们将 LNP 递送描述为一系列随机转移过程,并回顾了随后从 mRNA 进行蛋白质翻译的数学模型。我们汇编了从时间分辨显微镜获得的概率和数字。具体而言,单细胞阵列活细胞成像 (LISCA) 可以高通量采集数千个单独的 GFP 报告基因表达时间过程。这些轨迹可以得出 mRNA 寿命、表达率和表达开始时间的分布。相关性分析揭示了基因表达效率和转染开始时间的反向依赖关系。最后,我们讨论了为什么在多个核酸物种的共传递背景下,mRNA 释放的时间至关重要,例如在 mRNA 共表达或 CRISPR/Cas 基因编辑的情况下。