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CRUK 剑桥中心 MRes 轮换项目
轮换项目名称 使用 100 万个可诱导 DNA 条形码进行原位谱系追踪实验室主任 (PI) 姓名 Jamie Blundell 第二位指导老师（如适用） N/A 项目早期检测指导老师电子邮件 jrb75@cam.ac.uk 实验室位置 哈奇森 MRC 研究中心项目概要目的和目标维持血液、皮肤、肠道和其他组织的干细胞处于不断更新的状态，从而积累基因改变，其中一些导致克隆扩增和癌症 [1]。理解这一点需要能够测量组织维持期间发生的群体动态。在此，我们建议构建一个原位谱系追踪工具，该工具可以诱导生成数百万个 DNA 条形码组合，从而允许人们使用下一代测序以精确度并行追踪数百万个细胞谱系。与以前的半定量方法 [2] 不同，这项技术将能够定量追踪与体内组织维持相关的克隆动态，并深入了解如何实现体内平衡以及它在癌症早期阶段如何崩溃。我们之前在酿酒酵母中的工作已经证明，基于 cre-lox 系统的位点特异性 DNA 条形码和谱系动态的定量追踪可用于深入了解突变如何在大量细胞群体中产生、扩展和竞争 [3]。我们与长期合作伙伴 Sasha Levy 进一步开发了这项技术，现在可以原位生成条形码多样性，而无需转化质粒文库。这项改进的技术将利用 3 个串联 loxP“着陆垫”，每个“着陆垫”（在 Cre 诱导后）可以不可逆地整合存储在基因组其他地方的三个独立串联阵列中的约 100 个独特条形码序列中的一个。对于这个 MRes 轮换项目，我们计划扩大这项技术的规模，以在酵母中稳健地生成 100 万个独特的条形码组合。这将证明该技术能够以单细胞精度追踪体内细胞谱系，从而为干细胞生物学和癌症发病中的主要未解问题提供参考。实验计划 学生将首先构建由 loxP 位点分隔的约 100 个条形码组成的长串联阵列构建体，并使用标准同源重组将此构建体整合到已包含 cre-lox 着陆垫的酵母菌株的基因组中。然后，学生将研究此构建体可诱导的条形码多样性如何取决于串联阵列的诱导条件和基因组位置。优化后，学生将整合另外两个串联阵列，并尝试实现超过 100 万个独特条形码的多样性，将使用定制设计的 2 步 PCR 协议进行仔细量化，该协议使用唯一分子标识符 (UMI) 来标记单个 DNA 分子。
研究文章在棉花中氮酶蛋白的共表达（Gossypium Hirsutum L.）
化学氮肥可以维持作物生产力，但是化学氮肥过度使用会导致经济成本和环境污染。减少氮肥使用使用的一种方法是将氮酶生物合成途径转移到非乳状植物中。Fe蛋白是氮酶的两个结构成分。NIFB是一个关键的成熟酶，它催化了结合和减少n 2的氮酶Femo-Concactor的生物合成中的第一个投入步骤。NIFB，NIFH，NIFD和NIFK的表达对于产生能够固定大气N 2的植物至关重要。在这项研究中，Paenibacillu Polymyxa Wly78的四个基因（NIFB，NIFB，NIFD和NIFK）通过CRE/LOXP重组系统组装在植物表达vector PCAMBIA1301中，从而产生重组表达vector PCAM- bia1301301-nifbhdk。然后，使用tumefaciens介导的转化将表达载体中携带的四个NIF基因共同融入了高地棉R15。通过PCR和RT-PCR选择了T 3代的纯合转基因棉线B2，B5和B17。QRT-PCR显示，NIFB，NIFH，NIFD和NIFK在类似水平的转基因棉中共表达。Western印迹分析表明，NIFB，NIFH，NIFD和NIFK是在转基因棉中共同生产的。棉花中四种关键的NIF蛋白（NIFB，NIFH，NIFD和NIFK）的共表达是工程氮酶生物合成途径的重要一步。
使用工程化的 CD4+ 细胞归巢 mRNA-LNP 实现高效的 CD4+ T 细胞靶向和基因重组
核苷修饰的信使 RNA (mRNA)-脂质纳米颗粒 (LNP) 是首批两种 EUA（紧急使用授权）COVID-19 疫苗的基础。核苷修饰的 mRNA 作为药理学药剂的使用为治疗、预防和诊断分子干预开辟了巨大的机会。特别是，基于 mRNA 的药物可以特异性地调节免疫细胞，例如 T 淋巴细胞，用于肿瘤、传染病和其他疾病的免疫治疗。然而，关键的挑战是 T 细胞对外源 mRNA 的转染具有众所周知的抵抗力。在这里，我们报告将 CD4 抗体结合到 LNP 上可以实现对 CD4+ 细胞（包括 T 细胞）的特定靶向和 mRNA 干预。全身注射给小鼠后，CD4 靶向放射性标记的 mRNA-LNPs 在脾脏中积聚，与非靶向 mRNA-LNPs 相比，从脾脏分离的 T 细胞中的报告 mRNA 信号高 30 倍。静脉注射载有 Cre 重组酶编码 mRNA 的 CD4 靶向 LNPs 可产生特定的剂量依赖性 loxP 介导的基因重组，导致脾脏和淋巴结中分别约 60% 和 40% 的 CD4+ T 细胞表达报告基因。T 细胞表型显示 T 细胞亚群的转染均匀，在幼稚细胞、中枢记忆细胞和效应细胞中 CD4 靶向 mRNA-LNPs 的摄取没有差异。本研究建立的特异性和高效 mRNA 靶向和转染 T 细胞的方法为毁灭性疾病的免疫治疗和 HIV 治愈提供了平台技术。
用于恶性疟原虫基因功能研究的无泄漏诱导型 CRISPRi/a 系统
摘要 通过将催化失活的 Cas9 (dCas9) 与组蛋白脱乙酰酶 (Sir2a) 或乙酰转移酶 (GCN5) 的活性域融合，该 CRISPR 干扰/激活 (CRISPRi/a) 系统允许在转录水平上进行基因调控，而不会导致寄生虫基因组发生永久性变化。然而，dCas9 的组成性表达对研究必需基因构成了挑战，这可能会导致寄生虫的适应性变化，掩盖真正的表型。在这里，我们开发了一种无泄漏诱导型 CRISPRi/a 系统，通过整合 DiCre/loxP 调节子，允许在雷帕霉素瞬时诱导下表达 dCas9-GCN5/-Sir2a，这允许通过引入针对其转录起始区的向导 RNA 来方便地转录调控感兴趣的基因。利用在无性红细胞发育过程中处于沉默状态或从低水平到高水平表达的八种基因，我们评估了该系统在无性寄生虫中的稳健性和多功能性。对于大多数分析的基因，这种可诱导的 CRISPRi/a 系统导致目标基因在 mRNA 水平上上调或下调 1.5 到 3 倍。PfK13 和 PfMYST 表达的改变导致对青蒿素的敏感性改变。对于自噬相关蛋白 18（与青蒿素抗性相关的必需基因），通过可诱导的 CRISPRi/a 获得了 0.2 倍的上调或下调，导致生长迟缓。对于配子发生的主要调节器 PfAP2-G，通过 CRISPRa 获得了 0.10 倍的 PfAP2-G 转录本增加，导致。诱导寄生虫的配子体血症高出 4 倍。此外，可诱导的 CRISPRi/a 还可以调节配子体中的基因表达。这种可诱导的表观遗传调控系统为研究恶性疟原虫的基因功能提供了一种快速方法。
新闻通讯
几年前，宾夕法尼亚大学医学院资助了创建专用的老鼠胚胎冷冻保存设施。该设施位于解剖学化学大厦中的有安全房间中，并由核心监督。该设施目前包含9个液体N 2储罐（加上微型注射室中的工作罐），并带有警报和一个用于液体N 2补充的源罐。核心负责维持N 2 Dewar的完整性，并维护P.I.S.可以实时访问的最新计算机存储记录。每年对此冷冻仪服务的核心用户每年收费适中（中心成员$ 24/lin/yr）。该费用将根据用户提供的帐号通过我们的数据库每季度收集。用户可以监视其库存并与核心安排，以将样本发送给合作者。用户只需要为收件人提供联系信息，以及要发送的行的名称，核心将负责运输过程。两年前，转基因和嵌合小鼠的设施开始使用CRISPR-CAS9技术提供直接的基因组编辑服务。crisprs（群集定期散布的短底滴体重复序列）编码RNA（指导RNA）靶向与CRISPR相关的蛋白（CAS9）以特异性方式裂解DNA序列。在双链断裂之后，非同源末端连接产生了随机大小的目标缺失。这些基于CRISPR/CAS9的方法可显着减少产生转基因小鼠线的时间和资源。DNA裂解也可用于使用共同注射的单链或双链DNA模板来增强高保真同源重组。基于CRISPR-CAS9的直接基因组修饰服务在2014年纳入了核心服务，并迅速增加了其利用率。绝大多数项目使用或没有模板DNA的Cas9 RNA和SGRNA的注射组合。混合物被注入用户要求的选择菌株的受精小鼠卵母细胞的细胞质中。与DNA注射服务类似，注射的卵被培养为O/N，并将胚胎手术转移到假雌性中，并被允许延长。对于“敲入”和靶向序列修饰项目，在存在50 UM SCR7的情况下，将卵培养为O/N，这是一种连接酶IV的抑制剂，以增强同源重组（相对于非同源最终结合）事件。KO项目的成功率范围为5％-50％的活出生，并且经常出现双行性突变。KI项目仍然不太成功（3-10％），并且基于项目中的多个变量（基本替换，LOXP或TAG插入，大段插入），成功频率差异很大。核心继续监视所有项目的结果并收集有助于提高该技术效率的数据。http://www.med.upenn.edu/genetics/tcmf/http://www.med.upenn.edu/genetics/tcmf/
Presenilin-1条件敲除小鼠的应用程序处理和突触可塑性
连接的PS1突变总是会导致促进神经系统疾病的研究中心增加，特别是淀粉样蛋白生成物种A 42 Brigham and妇女医院（Duff等，1996; Jarrett等，1993; Scheuner et al。据推测，PS1本身可能具有哈佛医学院 - 分泌酶活性（Wolfe等，1999），这是马萨诸塞州波士顿02115的概念，由PS1直接结合，由pseptidomomi -3 Mind/Brain Mind/Brain Institute Metic Institute Metic -Scretase -Secretase -Secretase -Secretase -Secretase -Secretase -Secretase -Secretase -Secretase -Secretase -Secretors抑制器（Esler等人）（Esler et al li al li an li an li and li。这些发现提出了马里兰州21218 PS1的可能性，可能代表了抗敏感的脑和认知科学系的有吸引力的目标。学习和记忆中心PS1作为马萨诸塞州AD的治疗目标的可行性非常取决于降低PS1功能剑桥，马萨诸塞州02138在成人大脑中的影响。由于PS1 / 5梅奥诊所杰克逊维尔小鼠的围产期致死性，但先前关于佛罗里达州杰克逊维尔的应用程序处理的研究32224 32224 PS1的缺乏依赖于培养的神经元6 Howard Hughes Medical Institute衍生自胚胎PS1 /大脑。除了神经生物学中心和行为中心在应用程序处理中的作用外，我们先前对哥伦比亚大学PS1 /小鼠的研究表明，PS1在大脑发育过程中发挥了纽约10032的多效性效应，包括调节神经发生和缺口信号（Handler et al。，2000; Shen等，1997）。此外，Notch信号被限制在产后前脑。在没有PS1的情况下，神经前代汇总细胞过早地分化为有丝分裂后的神经元，导致祖细胞的早期消耗，我们开发了有条件的presenilin-1（ps1），随后是一个较小的神经元种群（han-oketut小鼠（CKO），在PS1 IS INARTACTIVINID中，Dive and。如小鼠所示，在PS1 /胚胎脑中诱导的PS1 CKO是可行的，并且没有明显的异常。降低了HES5表达并增加了DLL1表达的淀粉样蛋白pre-的羧基末端片段（Handler等，2000）。PS1似乎通过调节CKO小鼠的细胞内皮层的产生，而Notch1的-Amyloid结构域（De Strooper等，1999; Song peptides降低了。Notch Downstream等，1999）的表达在下游效应基因的晚期转录中不受影响，该基因不受影响，该基因不受影响。CKO皮层。尽管基础突触传播，但由于PS1 /小鼠的围产期致死性，PS1在成年大脑中的作用仍然未知长期增强和长期抑郁。re-hippocampal区域Ca1突触正常，PS1恰当地，秀丽隐杆线虫中PS1同源物中的突变，CKO小鼠在长SEL-12和HOP-1中表现出细微但显着的缺陷，导致缺陷导致缺陷术语空间记忆。缺陷而不会影响Notch向下的表达，以研究PS1失活对App Stream基因的影响。这些结果表明，在成年大脑皮层中PS1功能失活的神经形态中，两个胆碱能中间神经元，表明参与导致PS1在神经元功能中的一代和微妙的认知降低（Wittenburg等，2000）。处理，Notch信号通路以及成人大脑中的突触和认知功能，我们采用了CRE/LOXP重组系统来开发PS1条件敲除（CKO）小鼠。使用这种策略，Presenilin-1（PS1）的突变是最常见的PS1表达，在早期发作家族性阿尔茨海默氏病（FAD）的皮质原因中逐渐消除。从第三周开始的CKO小鼠开始。在-Amloid（A）肽的累积和沉积中，CKO小鼠的成年大脑皮层，大脑皮层中40的水平是早期和中心过程，而AD病原体的水平差异降低。A肽是生成App c末端片段（CTF）与淀粉样蛋白前体蛋白（APP）不同的，这是由于皱纹而导致的。令人惊讶的是，在CKO小鼠的皮质中未填充了凹槽下顺序的蛋白水解裂解的表达。Hippocampal 7信函中的基础突触传播和突触可塑性：jshen@rics.bwh.harvard.edu