95 ℃ 30 秒、40 ℃ 30 秒、72 ℃ 30 秒,25 个循环,最后 72 ℃ 延伸 5 分钟。第一轮 PCR 产物用 AMPure XP 磁珠(Beckman-Coulter,印第安纳波利斯,印第安纳州,美国)纯化。在第二轮 PCR 中,取 2 µL 纯化的第一轮产物与 NexteraXT Indexed Primers 一起用于最终文库构建。循环条件包括初始变性步骤 95 ℃ 3 分钟,然后 10 个循环 95
Miraldo A 1§* , Sundh J 2, * , Iwaszkiewicz-EggebrechtE 1 , Buczek M 3 , Goodsell R 1 , Johansson H 4 , Fisher BL 5 , Raharinjanahary D 6 , RajoelisonET 6 , Ranaivo C 6 , Randrianandrasana C 6 , Rafanomezantsoa JJ 6 , ManoharanL 7 , Granqvist E 1 , van Dijk LJA 1 , Alberg L 4 , Åhlén D 8 , Aspebo M 4 , Åström S 4 , BellvikenA 4 , Bergman PE 4 , Björklund S 4 , Björkman MP 9,10 , Deng J 3 , Desborough L 4 , DolffE 4 , Eliasson A 4 , Elmquist H 4 , Emanuelsson H 4 , Erixon R 11 , Fahlen L 4 , Frogner C 4 ,Fürst P 4 , Grabs A 4 , Grudd H 12 , Guasconi D 13 , Gunnarsson M 4 , Häggqvist S 4 , Hed A 4 ,Hörnström E 4 , Johansson H 4 , Jönsson A 4 , Kanerot S 4 , Karlsson A 4 , Karlsson D 4 ,Klinth M 4 , Kraft T 4 , Lahti R 14 , Larsson M 4 , Lernefalk H 4 , Lestander Y 4 , Lindholm LT 4 , LindholmM 4 , Ljung U 4 , Ljung K 4 , Lundberg J 15 , Lundin E 12 , Malmenius M 4 , Marquina D 1,# ,Martinelli J 4 , Mertz L 4 , Nilsson J 4 , Patchett A 16 , Persson N 4 , Persson J 4 , Prus-FrankowskaM 3 , Regazzoni E 4 , Rosander KG 4 , Rydgård M 4 , Sandblom C 4 , Skord J 4 , StålhandskeT 16,17 , Svensson F 4 , Szpryngiel S 1 , Tajani K 17 , Tyboni M 4 , Ugarph C 4 , Vestermark L 4 , Vilhelmsson J 4 , Wahlgren N 4 , Wass A 4 , Wetterstrand P 4 , Łukasik P 1,3,† , Tack AJM 8,† ,Andersson AF 18,† , Roslin T 19,20,† , Ronquist F 1,†
1诺丁汉大学马来西亚大学环境和地理科学学院海洋生物学的高级研究,印度波托纳诺沃海洋科学学院,马来西亚马来西亚科学学院4个生物科学学院,马来西亚科学院4个生物科学研究所Sumatera utara,梅德岛,印度尼西亚,6大学渔业与水产养殖研究所,塞里克·安塔(Cheikh Anta Dip),达卡(Dakar),塞内加尔(Dept),第7部。渔业生物学和遗传学,渔业学院,水产养殖与海洋科学,Sher-e-e-bangla农业大学,达卡,孟加拉国,孟加拉国8伊奥莫特站,8伊奥米特站,瑞哈拉大学,Uehara,UEHARA,UEHARA,UEHARA,UEHARA,UEHARA,UEHARA,UEHARA Taketomi,Yayama,冲绳,日本,
环境DNA(EDNA)近年来成为补充水生淡水系统传统抽样方法的主要方法。尽管越来越多地应用Edna Metabarcoding方法,但许多发展中国家尚未将该工具完全纳入水生生物多样性的管理和监测。这项研究旨在分析Mweru-Luapula(ML)渔业的18个抽样地点首次收集的EDNA水样品,以确定侵入性和天然淡水鱼的存在和分布。这项研究进一步应用了Simpson多样性指数(SDI),以研究入侵和无侵蚀系统之间物种的多样性。环境DNA分析揭示了渔业四个层中三个层中存在侵入性帕尚种类,而在通过传统方法进行评估时,只有两个先前已知的层被侵入。此外,最初还使用EDNA检测了五种稀有物种(Marcusenius senegalensis,senegalensis,Trachurus japonicus,Labeo Nasus,Campylomormyrus Compressirostris和Synodontis Schoutedeni)。在入侵的单个采样位点记录了低SDI值。系数作为读数和物种频率之间的社会(r = 0.31; p值= 0.239)和多样性指数(r = 0.1; p -value = 0.717)没有任何重大影响。这项研究提供了一个平台,以进一步研究在全国其他渔业地区的入侵物种的存在和影响,使用在不同水深收集的Edna水样品来更新物种库存。在渔业中首次启示了意外物种,并在多个地点发现了侵入性的帕尚种类,这表明需要与传统的方法一起介绍Edna Metabarcododing,以监测外星人的入侵物种,从而有效地管理和保存淡水ML Fishery fishery fishery fishery fishery fisoticational of Zambia的威胁性生物多样性。
要将以环境得出的元编码数据转换为社区矩阵进行生态分析,必须首先将序列聚集到操作分类单元(OTU)中。此任务对于包括大量带有不完整参考库的数据,包括大量的分类单元。OptimoTU提供了一种具有分类学意识的OTU聚类方法。它使用一组分类学识别的参考序列来选择最佳的遗传距离阈值,以将每个祖先分类群分组为最与后代分类单元最匹配的集群。然后,查询序列根据初步分类学标识和其祖先分类群的优化阈值聚类。该过程遵循分类学层次结构,从而将所有查询序列的所有查询序列完全分类为命名的分类学组以及占位符“ Pseudotaxa”,这些序列适合无法分类为相应等级的命名分类单元的序列。Optimutu聚类算法是作为R软件包实现的,在C ++中实现了速度的计算密集步骤,并合并了成对序列对齐的开源库库。距离也可以在外部计算,并且可以从UNIX管道中读取,从而允许大型数据集聚类,在该数据集中,整个距离矩阵将不方便地存储在内存中。Optimutu生物信息学管道包括一个完整的工作流程,用于配对端的Illumina测序数据,其中包含了质量过滤,DeNoising,Wratifact删除,分类学分类以及与Optimotu的OTU集群。开发了用于高性能计算簇的OptimoTU管道,并将其缩放到每个样品和数万个样本的数据集中。
1。在密歇根州立大学的研究技术支持机构(RTSF)上进行了二级扩增和NGS。将每种纯化的原代PCR产物的20μL等分试样送到MSU的RTSF基因组核心,以用于临时PCR扩增,该引物针对主要PCR产物的CS1/CS2末端,并添加了双重索引,具有双重指标的,光明的,光明的兼容型适配器与酒吧尺度。
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需要为鱼类社区组成建立现实的目标来评估河流修复项目的有效性。,我们使用了与米里什底漆的环境DNA(EDNA)元法编码,以获取估计位于日本Ehime ehime Prefecture的Shigenobu River System的上游,下游和恢复缓解项目区域(Kaihotsu - Kasumi)的17个地点(Kaihotsu - Kasumi)的估计。我们评估了使用Edna快速,敏感和广泛收集数据的好处,以在恢复区建立现有的鱼类群落组成,以及物种组合的潜在的短期,中期和长期目标,这些物种组合可能在分散到来自上游和下游群体的项目区域后现实地出现。我们将Edna Metabarcodod的结果与从同时捕获调查和历史信息获得的物种列表进行了比较。从埃德纳(Edna Surveys)获得的社区组成的非衡量多维标度图显示,Kaihotsu - Kasumi恢复区和周围的河流及其河流分为三个簇:上游,中层和下游及河口和河口。Kaihotsu - Kasumi恢复区位点包含在恢复区附近的流入和流出河流的中间和下到达的组中。我们在这一组中检测到了总共26种,二十一种本地物种和五个非本地物种。因此,这些本地物种被认为是短期目标物种,其散布到Kaihotsu - Kasumi恢复区域。相比之下,基于捕获调查和历史文献,只有14种被选为目标物种。增加了我们埃德纳调查的分辨率的一个因素是我们确定存在a anguillicaudatus(进化枝A和B)的种内谱系的能力,这些谱系被捕获调查遗漏了。这些结果表明,与捕获调查相比,EDNA Metabarcoding方法可以提供更全面和现实的短期目标物种估计,并通过种内谱系检测提供更高的分辨率监测。
fi g u r e 2 edna测序读数的变化(Hellinger被改造并用作代理人的丰度),用于包括(A)Lee河和(B)Richmond Lock的Thames Sites的鱼类的鱼类。颜色强度和较大的点都表明了测序读数的丰度。丰富性基于3个生物学重复中的2种中存在的物种。
在微生物群落测序中,涉及细菌核糖体16S rDNA或真菌ITS,靶向基因是分类学分配的基础。传统的生物信息程序已有数十年的历史使用了一个聚类协议,该协议通过该协议将序列汇总到共享百分比身份的包装中,通常为97%,以产生运营技术单位(OTU)。数据处理方法中的进展导致了最小化技术测序符错误的可能性,这是OTU选择的主要原因,而是分析确切的Amplicon序列变体(ASV),这是一种选择,这会产生较少的聚集读数。我们已经在相同16S的元编码细菌扩增子数据集上测试了这两个程序,这些数据集包含来自17个相邻栖息地的一系列样品,这些样品跨越了700米长的不同生态条件的700米长的样本,这些样本在从农田,通过山地,森林,森林过渡到同一海岸的梯度,从农田跨度跨越了梯度。这种设计允许扫描高生物多样性盆地,并测量该地区的α,β和伽玛多样性,以验证生物信息学对十个不同生态索引和其他参数的值的效果。将两个级别的进行性OTU聚类(99%和97%)与ASV数据进行了比较。结果表明,OTU群集成比例地导致了物种多样性的生态指标值的明显低估,以及有关直接使用ASV数据的主导性和均匀性指数的扭曲行为。多元定序分析在树拓扑和连贯性方面也引起了敏感。总体而言,数据支持这样的观点:基于参考的OTU聚类带来了几种误导性的劣势,包括缺少新颖的分类单元的风险,这些偏见尚未在数据库中引用。由于其替代品作为从头聚类的替代方案,另一方面,由于计算需求较重和结果可比性,尤其是对于包含几种但未表征的物种的环境研究,至少对于原核生物而言,与OTU Clus-Clus-Clus-tering titer titer catiftitions catiftitions cotoff cotoff cotoff cotoff conforp的含义,至少是基于ASV的直接分析。