grasp65是一种由高尔基体相关的外围蛋白,该蛋白由Gorasp1基因编码,并且在体外堆叠了高尔基体蓄水系统所需。也已经提出了Grasp65在细胞分裂调节中的关键作用。然而,小鼠中Grasp65的耗竭对高尔基体结构的影响很小,迄今为止,该基因尚未与任何人类表型相关。在这里,我们报告了GORASP1(C.1170_1171DEL; P.ASP390GLUFS*18)的第一个人类致病变异的识别,该患者将神经发育障碍与神经增强性,Neuromuscu-神经肌肉,神经肌肉和骨骼异常相结合。功能分析表明,这种变体导致完全缺乏GRASP65。高尔基体的结构没有显示出碎片化,但是检测到诸如低溶性等异常的糖基异常。有丝分析分析表明,与极性染色体的突起酶和中期过量过多,表明细胞周期会延迟。在RPE细胞中概括了这些表型,其中CRISPR/CAS9引入了类似的突变。这些结果表明,人类中的grasp65丢失引起与糖基化和有丝分裂进程中缺陷相关的新型高尔基体病。
图3:这无疑是本文中最重要的信息之一。i认识到糖基化总体上受到影响,但在这个水平上,通过质谱来深入分析患者细胞的N-糖基化状态至关重要,以了解这种缺陷,戈尔吉帕蒂和糖基化之间的联系。作者使用WGA确认其糖基化缺陷。我会建议他们重复SNA和MAA的实验,这些实验是更具体的凝集蛋白。作者检测到apociii糖基化缺陷,而在转铁蛋白中无。在O-Glycans上发生的溶苷位在Alpha 2,3中,而对于N-Glycans,这主要是Alpha 2,6。缺陷可能只会影响α2,3溶性。使用两个凝集素SNA和MAA的使用应回答这个问题,但这就是为什么通过质谱法中患者细胞的N-糖基化状态很重要。这也可以在本文第二部分中使用的RPE突变细胞中完成。
grasp65是一种由高尔基体相关的外围蛋白,该蛋白由Gorasp1基因编码,并且在体外堆叠了高尔基体蓄水系统所需。也已经提出了Grasp65在细胞分裂调节中的关键作用。然而,小鼠中Grasp65的耗竭对高尔基体结构的影响很小,迄今为止,该基因尚未与任何人类表型相关。在这里,我们报告了GORASP1(C.1170_1171DEL; P.ASP390GLUFS*18)的第一个人类致病变异的识别,该患者将神经发育障碍与神经增强性,Neuromuscu-神经肌肉,神经肌肉和骨骼异常相结合。功能分析表明,这种变体导致完全缺乏GRASP65。高尔基体的结构没有显示出碎片化,但是检测到诸如低溶性等异常的糖基异常。有丝分析分析表明,与极性染色体的突起酶和中期过量过多,表明细胞周期会延迟。在RPE细胞中概括了这些表型,其中CRISPR/CAS9引入了类似的突变。这些结果表明,人类中的grasp65丢失引起与糖基化和有丝分裂进程中缺陷相关的新型高尔基体病。
摘要 芽殖酵母的有丝分裂退出取决于有丝分裂纺锤体沿细胞极性轴的正确定位。当纺锤体无法准确定位时,一种名为纺锤体位置检查点 (SPOC) 的监视机制会阻止细胞退出有丝分裂。具有缺陷 SPOC 的突变体会变成多核并失去其基因组完整性。然而,对 SPOC 机制的全面了解尚不足。在本研究中,我们确定了 1 型蛋白磷酸酶 Glc7 与其调节蛋白 Bud14 相关联,这是一种新的检查点成分。我们进一步表明,Glc7-Bud14 促进了 SPOC 效应蛋白 Bfa1 的去磷酸化。我们的结果表明,两种机制并行作用以产生强大的检查点反应:首先,SPOC 激酶 Kin4 将 Bfa1 与抑制激酶 Cdc5 隔离开来,其次,Glc7-Bud14 使 Bfa1 去磷酸化以完全激活检查点效应物。
缩写ACC,腺样囊性癌;芯片,染色质免疫沉淀; CHIP-SEQ,染色质免疫沉淀测序; dab,二氨基苯甲胺; dox,多西环素; EV,空矢量; FDR,错误发现率; GFP,绿色荧光蛋白;去,基因本体论; GSEA,基因集富集分析; HEGF,人类表皮生长因子; Mac,基于模型的芯片序列分析; MBS,MYB绑定站点; NES,归一化富集评分; NSG,正常的唾液腺; p adj,p值调整; PDX,患者衍生的异种移植物; penstrep,青霉素 - 链霉素; RLU,相对光单元; RMA,强大的多阵列平均值; RNA-seq,RNA测序; RT-QPCR,实时定量PCR; siRNA,小干扰RNA; TMA,组织微阵列; TSS,转录开始站点;谁,世界卫生组织; XPDX,Xenostart患者衍生的异种移植物。
为了分析有丝分裂过程中细胞结构的分析,需要纳米分辨率来可视化纺锤体中微管的组织。在这里,我们提出了一种详细的方案,可用于在培养物中生长的细胞中整个有丝分裂纺锤体的3D重建。为此,我们将富含有丝分裂阶段的哺乳动物细胞附着在蓝宝石盘上。我们的协议进一步涉及通过高压冻结,冻结固定和树脂嵌入的冷冻污染。然后,我们使用荧光光学显微镜在树脂包裹的样品中选择有丝分裂细胞。接下来是大规模电子断层扫描,以重建3D中所选的有丝分裂纺锤体。然后,生成和缝合的电子断层图用于半自动分段微管,以进行纺锤体组织的随后定量分析。因此,通过提供详细的相关光和电子显微镜(CLEM)方法,我们为细胞生物学家提供了一种工具集来简化纺锤体微管的3D可视化和分析(http://kiewisz.shinyapps.io/asga)。此外,我们指的是一个最近启动的平台,该平台允许交互式显示3D重建有丝分裂纺锤体(https://cfci.shinyapps.io/asga_3dviewer/)。
为了分析有丝分裂过程中细胞结构的分析,需要纳米分辨率来可视化纺锤体中微管的组织。在这里,我们提出了一种详细的方案,可用于在培养物中生长的细胞中整个有丝分裂纺锤体的3D重建。为此,我们将富含有丝分裂阶段的哺乳动物细胞附着在蓝宝石盘上。我们的协议进一步涉及通过高压冻结,冻结固定和树脂嵌入的冷冻污染。然后,我们使用荧光光学显微镜在树脂包裹的样品中选择有丝分裂细胞。接下来是大规模电子断层扫描,以重建3D中所选的有丝分裂纺锤体。然后,生成和缝合的电子断层图用于半自动分段微管,以进行纺锤体组织的随后定量分析。因此,通过提供详细的相关光和电子显微镜(CLEM)方法,我们为细胞生物学家提供了一种工具集来简化纺锤体微管的3D可视化和分析(http://kiewisz.shinyapps.io/asga)。此外,我们指的是一个最近启动的平台,该平台允许交互式显示3D重建有丝分裂纺锤体(https://cfci.shinyapps.io/asga_3dviewer/)。
1个在Onco-Muno-Herasology(LIM-31)的发病机理和靶向疗法的医学研究实验室(LIM-31),内科系,血液学部,ST-o Paulo University faculdade de Medicina,SãoPaulo,SãoPaulo 01246-903,巴西; kelilima@usp.br(K.L.); marianenasc@hotmail.com(m.c.d.n.); edumrego@hotmail.com(E.M.R.)2生物医学科学研究所,萨尔·保罗大学,巴西sâo paulo 05508-000; liviamirands@usp.br(L.B.L.D.M.); bruolialmeida@usp.br(B.O.D.A.); drguilhermealcantara.usp@gmail.com(g.a.s.a.)3生物医学研究所的细胞和发育生物学系,萨尔·保罗大学,巴西s-o paulo 05508-000; anabega@usp.br(A.D.M.B.G.); glaucia.usp@gmail.com(G.M.M.-S。) *通信:jamachadoneto@usp.br;电话。: +55-11-3091-7467
人类蛋白质编码基因的身份众所周知,但我们对其分子功能和域结构的深入了解仍然受到基于同源性的预测和专注于全基因耗竭的实验方法的缺陷的限制。为了弥补这一知识空白,我们开发了一种方法,利用 CRISPR - Cas9 诱导的蛋白质编码基因突变来先验地识别序列水平的功能区域。作为一个测试案例,我们将这种方法应用于 48 个人类有丝分裂基因,揭示了细胞增殖所需的数百个区域,包括实验表征的区域、基于同源性预测的区域和新区域。我们验证了 15 个区域的筛选结果,包括 Mad1 的 387 - 402 个氨基酸,这些氨基酸以前未被表征,但有助于 Mad1 着丝粒定位和染色体分离保真度。总之,我们证明基于 CRISPR - Cas9 的平铺诱变可以从头识别蛋白质编码基因中的关键功能域,从而阐明功能突变体的分离并允许跨人类蛋白质组的功能注释。
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