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Cyberwal在Galaxia计划2024 -Dossier de Presse
俯冲的损失是网络攻击的主要结果。后者可能会瘫痪公司的运营，从而导致巨大的生产力损失，这可能会对公司的运营产生延长的影响。此外，客户的声誉和信心通常会受到成功攻击的严重影响，导致当前和潜在客户的损失以及对消费者和商业伙伴的长期忠诚度产生负面影响。此外，遭受数据违规的公司可能会面临监管罚款和制裁，特别是如果他们不遵守严格的法规，例如欧洲的GDPR。这些罚款可能是可观的，并为攻击本身已经产生的成本增加了额外的财务负担。enfi n，带有MontéeDesCybe Rat Taques，Assur Ance Ance Cybernetique E NT的索赔与GM Entertionment相当，这是一个地位，因为它是Entrepris e s ui寻求覆盖自身与C Yberscur Ite风险相比的位置。
卢顿（英国），2023 年 11 月 14 日 Telespazio 收购 e2E，以增强英国的综合太空能力
Telespazio UK 是 Telespazio（Leonardo 和 Thales 合资成立，持股 67%，持股 33%）的子公司，今天宣布已完成对 e2E 集团的收购。Telespazio UK 在英国市场拥有超过 45 年的经验，在为欧洲航天局 (ESA)、欧洲中期天气预报中心 (ECMWF)、太空项目以及国家民用和国防客户提供系统、服务和工程支持方面拥有成功记录。Telespazio UK 的空间领域专业知识涵盖地球观测/地理信息/科学探索数据系统、弹性导航和授时、空间领域感知、民用/国防地面部分以及下游应用和气候服务。e2E 集团总部位于韦林花园城，是英国领先的独立空间系统工程和咨询集团，提供高水准和定制的技术支持和专业知识。自 1999 年以来，e2E 一直提供系统工程和技术咨询服务，包括开发卫星操作软件、集成和测试新空间系统、确保通信服务、开发下一代系统架构以及开发涉及软件定义无线电 (SDR)、片上系统 (SoC) 实施以及射频 (RF) 和自由空间光通信的首次概念验证演示。e2E 集团投资于领先的通信技术开发，获得了领域知识和知识产权，这些知识和知识产权正应用于多个旨在造福卫星通信行业的新项目。e2E 的深厚卫星通信工程专业知识的加入增强了 Telespazio UK 提供空间服务的能力，而 e2E 与国防和商业客户合作的悠久历史与 Telespazio UK 与机构客户的数十年合作历史相得益彰。此次收购是 Telespazio UK 为民用和国防领域国家空间战略实施做出重大贡献的征程迈出的重要一步。
卷378编号2全编号1089 2025年2月...
通过粗几何形状885詹妮弗·邓肯（Jennifer Duncan）的厚度嵌入对称空间中，这是球不等式的非线性变体。。。。。。。。。。。。。。。911 Yuchen Bi和Jie Zhou，Varifolds的最佳刚度估计值几乎最小化Willmore Energy。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。943 S.。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。967 Boris Bychkov，Petr Dunin-Barkowski，Kazarian和Sergey Shadrin，拓扑递归的符号义务。。。。。。。。。。。。。。。。1001 Nasrin Altafi，Robert Di Gennnaro，Federico Galetto，Sean Grete，Rosa M. Mir´o-Roig，Uwe Nagel，Artinian Gorenstein，Artinian Gorenstein。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。1055 J. Charatonik，Alexandra Kwiatkowska和Robert P. Roe，。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。1081 Ciprian A. Tudor，多维Stein方法和定量渐近独立性。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。1127 Sean Monahan，Halosphical Stacks和堆放的颜色风扇。。。。。。。。。。。1167 hao pan，Ergodic复发和素数之间的界限。。。。。。。。。。1215 Andr´e Guerra，Xavier Lamy和Konstantinos Zemas，在任意维度中的球体价值图中M obius组的急剧定量稳定性。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。1235 Kevin Ford和Mikhail R. Gabdullin，多项式连续复合值的长字符串。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。1261 Zhicheng Wang，Lusztig对应和有限的Gan-Gross-Prosad问题。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。1283。。。。。。。。。。。。。1329 1329和Coutiannis，Anh N. Le，Joel Moreira，Ronnie Pavlov和Florian K. 1373JoakimFærgeman，第四个钢化D模块。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 1401 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。1329和Coutiannis，Anh N. Le，Joel Moreira，Ronnie Pavlov和Florian K.1373JoakimFærgeman，第四个钢化D模块。。。。。。。。。。。。1401。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。1433 VALOV的VESK，同质ANR空间的结构。。。。。。。。。。。。。。1449法国人和马汉MJ，阿诺索夫。1465
Roger Myers博士顾问，R Myers Consulting LLC
经验摘要罗杰·迈尔斯（Roger Myers）博士拥有30多年的经验，用于开发，测试和生产飞行空间推进技术和NASA，国家安全和商业空间任务的所有类型的系统。此外，他花了多年的领导团队来研究所有空间市场的航天器任务要求，能力，设计和建筑，并为工程团队的领导力和计划和业务管理制定策略和策略。他的经验从动手研究和开发到领导小型创新团队，再到总经理，作为全球最大的开发商和空间推进技术和系统的生产商，Aerojet Rocketdyne在华盛顿雷德蒙德的Aerojet Rocketdyne的400多人站点。他在化学，电气和核推进系统的开发和生产方面的经验及其对所有航天器尺寸和应用的整合要求和挑战为评估新的挑战和机遇提供了广泛的基础，以及他在美国和国际太空社区的广泛联系，使他能够促进新的联系并创造新的机会。迈尔斯博士还是华盛顿州科学院的校长，华盛顿州航空技术创新联合中心的主席，也是电力火箭推进学会（2013 - 2020年校长）和西雅图飞行博物馆的董事会成员。此外，迈尔斯博士还支持他在国家学院委员会任职的社区，并发表演讲和讲座。Education BS Aerospace Engineering, summa cum laude, University of Michigan, 1984 Ph.D, Mechanical and Aerospace Engineering, Princeton University, 1989 Experience July 2016 – present: independent consultant, R Myers Consulting, LLC 2013-July 2016: Executive Director, Advanced In-Space Programs, Aerojet Rocketdyne 2011 – 2013: Executive Director, Electric Propulsion and Integrated Systems, Aerojet 2010 – 2011:副主管，空间和启动系统和执行。电力推进与集成系统主管，AeroJet，2006-2010：Aerojet Redmond Operations总经理2005-2006：系统和技术开发执行总监，系统与技术开发，AeroJet 2002-2005：系统与技术开发总监，Aerojet 1996-2002，导演，电动和太空领域的总监，Olin Electies，Olin Aervospace，Prime Spire Space 9：Olin Aerfospace，PrimeS技术，GD技术，GD技术，GD-1-1，GD技术，GD-1-1，GD-GD技术，1-1 NASA Glenn研究中心（当时刘易斯）的小组主管（Sverdrup and Nyma）进行并监督空间内推进研究奖项，并授予Stuhlinger在电气推进方面取得杰出成就的Stuhlinger奖章，电力火箭推进社会，2017年WYLD PREPULS SORICICE，2017年WYLD PREPULS奖，美国航空宣布，2014年Aerononoterics，2014年，SIC Aernocection of Aernation and Aernocections，2014年，Aernation of Aernonoterics，2014年） （当选），美国航空与宇航学研究所，2010年欧洲航天局“对Smart-1 Mission的杰出贡献”，2003年NASA奖，因“将目标变成现实”而获得了对NASA Solar Electric Electric Prosuls Technology afferiness（NSTAR）的杰出贡献（NSTAR）团队的杰出贡献，2001年
使用 shor 量子计算破解 rsa 加密
摘要：得益于最近硬件的进步，量子计算是一个快速发展的研究领域。量子计算机的量子力学特性使它们能够比传统计算机更快地解决某些问题。其中一个问题是非结构化搜索问题，使用众所周知的 Grover 算法，量子机可以比目前可用的最佳效率经典算法（即线性搜索）更高效地解决该问题。量子 p 计算为此类问题提供了二次加速，O(N)，而传统算法提供的线性效率为 O(N)，其中 N 是搜索空间。另一个非常重要的应用是多项式时间量子算法，称为 Shor 算法，用于分解整数和计算离散对数。Shors 算法是第一个实现比传统算法指数加速的量子算法，应用于量子力学领域以外的问题，具有明显的应用价值。具体来说，Shors 算法可用于破解基于对两个大小相似的素数乘积进行因式分解的难度的 RSA 密码体制，以及基于离散对数问题 (DLP) 的密码体制，例如 Diffie-Hellman 密钥协商协议和数字签名算法。Shors 因式分解算法执行的最昂贵的操作是模幂运算。现代经典计算机可以在一秒内对数千位数字执行模幂运算。这两个事实乍一看似乎表明使用 Shors 算法对一千位数进行因式分解只需要几秒钟，但不幸的是（或许幸运的是），事实并非如此。Shors 算法中的模幂运算是在指数叠加上执行的，这意味着需要量子计算机，而量子硬件的噪声预计会比经典硬件高出几个数量级。这种噪声需要使用纠错，这会带来开销，最终使得在量子计算机上执行可靠算术的成本比在传统计算机上高出几个数量级。尽管 Shors 算法在多项式时间内运行，但渐近符号隐藏的常数因子相当大。必须通过各个层面的大量优化来克服这些常数因子，才能使算法实用。目前的量子计算机还远远不能执行与密码相关的问题规模的 Shors 算法。本文提出了一种实现 Shors 量子因式分解算法的方法和实验。实现是使用 Python 和量子计算机模拟完成的
最终---2024 年 12 月 12 日董事会会议记录-(...
2024 年 12 月 12 日下午 4:45 在宾夕法尼亚州匹兹堡 Preble Avenue 3300 号管理局办公室召开会议。与会人员包括董事会成员 Shannah Tharp-Gilliam 博士、Sylvia 女士、Harry Readshaw 先生、Darrin Kelly 先生和 Paul Klein 先生（通过 zoom）。Theresa Kail-Smith 女士和 Emily Kinkead 女士缺席会议。Arletta Scott Williams 女士、Kimberly Kennedy 女士、Michelle Buys 女士、Karen Fantoni 女士和 Suzanne Thomas 女士也参加了会议。Michael Lichte 先生、Douglas Jackson 先生（管理局工作人员）、Max Junker 先生（Babst Calland 先生）和 Colin Lampark 先生（HATCH 先生）。所有人都起立宣誓效忠。本次会议没有公开评论。 Shannah Tharp-Gilliam 博士表示，在本次会议开始之前有一个执行会议，当时不进行投票。财务总监 Karen Fantoni 报告了 2025 年运营和资本预算。解释了这个过程，意识到它需要长达五个月的时间才能完成。团队合作涉及每个部门、经理和董事，将预算提交给董事会，供您在今天的议程上审议。随着所有财务在 8 月结束，我们继续举行了三天的部门会议，并逐一检查了每个项目并审查了费率模型。我们正处于 2021 年通过的五年费率决议的第四年。我们的咨询工程师、来自 HATCH Consulting 的 Colin Lampark 也审查了这个过程。董事会进行了一次审查，在 11 月将草案提交给董事会，从那时起，我们就能够解决董事会成员向我们提出的所有问题和疑虑。预算获得批准后，信托契约要求我们获得最终运营预算和咨询工程师报告的副本给受托人。一些亮点是，我们计划在 2025 年增加 7% 的利率，这将为自筹资金提供额外资金。与通过债务和债券融资相比，我们为一些资本项目自筹资金更便宜。不幸的是，我们将来会发行大量债券，以增加债务偿还金额。我们之前谈到了 2024 年发行新债券，我们将发行债券，希望是在 2025 年，等等，以便继续资助清洁水计划和其他必须通过我们的有机资本计划完成的资本项目。工程和建筑总监 Kimberly Kennedy 详细介绍了 2025 年以及我们预计的支出。前六名将包括 CSO 旁路和消毒项目，该项目已经实施了两年，还有两年就要完工。我们最近获得了固体浓缩和脱水改进项目。该项目昨天由四位素数嘉宾拉开帷幕，我们预计明年该项目将吸引大量投资，总投资额将达到 2800 万美元。我们还将于明年完成两个主要项目的设计和投标：雨天泵站和俄亥俄河隧道。我们大约有 1400 万美元，用于雨天泵站的投标阶段。在施工方面，俄亥俄河隧道约需 1000 万美元。我们将于明年完成北端工厂扩建，并开始设计阿勒格尼河隧道。咨询工程师 (HATCH) Colin Lampark 提交了 2024 年的咨询工程师报告。该报告总结了年度报告中的内容，这些内容将在会议上考虑批准。本报告是全年工作的总结。
马耳他国家能源和气候计划
表 1 - 1990-2022 年 LULUCF 部门的气体温室气体排放量/清除量（使用 AR5 GWP 计算）（kt CO¬2¬ eq）。来源：马耳他国家温室气体报告 ............................................................................................. 60 表 2 - 温室气体排放部门份额。来源：CAA ........................................................................................... 60 表 3 - 马耳他到 2030 年的可再生能源贡献，百分比 .............................................................................................. 83 表 4 - 2016-2018 年最终能源消耗 .............................................................................................................. 95 表 5 - 平均净使用量（kWh/m2/年 - 指示性预期进展（2021 年长期改造战略第 102 页表 7-4） ............................................................................................................. 97 表 6 - 每年总排放量（千吨二氧化碳）- 指示性预期进展（2021 年长期改造战略第 102 页表 7-5） ............................................................................................................. 97 表 7 - 第二条电力互连器的技术参数。来源：ICM ............................................................................. 115 表 8 - 截至 2023 年底的光伏容量 ............................................................................................................. 139 表 9 - 使用公共交通工具的乘客总数交通运输 2021-2022 ...................................................... 161 表 10 - 建筑最低能源性能水平。来源：BCA .............................................................. 179 表 11 - 自 2010 年以来的年度峰值需求。来源：Enemalta .............................................................. 193 表 12 - 能源部门实施的措施 ...................................................................................... 218 表 13 - 交通运输部门实施的措施 ...................................................................................... 220 表 14 - 总人口和家庭数量。来源：根据财政和就业部预测，预计人口和家庭入住率。............................................................................. 228 表 15 - 预计五年平均 GDP 增长率，百分比 来源：财政和就业部。 ........................................................................................................................................... 230 表 16 - 2030 年经济部门（不包括交通运输）的最终能源消耗 ........................................................ 236 表 17 - 太阳能光伏技术成本假设，2015 欧元/千瓦（不含税）。来源：Primes 2020 技术假设。 .................................................................................................................... 244 表 18 - 住宅规模太阳能光伏成本，2022 年实际价格 来源：REWS。 ...................................................................... 244 表 19 - 成本降低情景，2014 欧元/千瓦（不含税）。来源：Fraunhofer ISE。 .............................................................................................................245 表 20-海上风电场成本（2021 年实际价格）.............................................................. 249 表 21-住宅和商业部门技术的技术假设 ...................................................... 253 表 22-各部门历史温室气体排放量（Gg CO2 当量）。来源：2024 年温室气体清单报告。.. 255 表 23-与 GDP 相比的排放量趋势（tCO2 当量）。来源：2024 年温室气体清单报告。. 256 表 24-按气体划分的温室气体排放趋势。来源：CAA。................................................................ 261 表 25-2010 年至 2022 年可再生能源在最终能源消费总量和每个部门中的份额。来源：欧盟统计局，SHARES 工具。 ........................................................................................... 279 表 26 - 最终可再生能源消耗，单位：GWh .............................................................................. 279 表 27 - 各部门的一次能源和最终能源消耗（不包括环境热），ktoe ........................ 285 表 28 - 各部门的一次能源和最终能源消耗（包括环境热），ktoe ........................ 285 表 29 - 2017 年至 2022 年按来源划分的液化天然气交付量。来源：欧盟统计局。 .................................................... 293 表 30 - 2017 年至 2022 年马耳他发电部门的天然气交付量。来源：能源和水务服务监管机构。 ......................................................................................................... 293 表 31 - 现有马耳他-西西里电力互连器的详细信息。 ................................................................. 295 表 32 - 2024 年清洁能源转型伙伴关系 (CETPartnership) 呼叫模块 .............................................. 306 表 33 - SINO 马耳他基金资助的项目 ............................................................................................. 307 表 34 - FUSION 资助的项目 ............................................................................................................. 307 表 35 - 与能源效率维度相一致的项目 ............................................................................................. 309 表 36 - 与脱碳相一致的项目：可再生能源 ............................................................................. 309 表 37 - 与脱碳相一致的项目：温室气体减排 ............................................................................. 311 表 38 - 与能源安全相一致的项目 ............................................................................................. 312来源：CAA。 ........................................................... 261 表 25-2010 年至 2022 年可再生能源在最终能源消费总量和各部门总消费中的占比。 来源：欧盟统计局，SHARES 工具。 ............................................................................................. 279 表 26-最终可再生能源消费，单位：GWh ............................................................................. 279 表 27-各部门一次能源和最终能源消费（不包括环境热），ktoe ............................................................................................. 285 表 28-各部门一次能源和最终能源消费（包括环境热），ktoe ............................................................................................. 285 表 29-2017 年至 2022 年按来源划分的 LNG 交付量。 来源：欧盟统计局。 .................................................................... 293 表 30-2017 年至 2022 年马耳他发电部门的天然气交付量。 来源：能源和水务服务监管机构。 ........................................................................................................... 293 表 31 - 现有马耳他-西西里电力互连器的详细信息。 .............................................................................. 295 表 32 - 2024 年清洁能源转型伙伴关系 (CETPartnership) 呼叫模块 ........................................ 306 表 33 - SINO 马耳他基金资助的项目 ............................................................................................. 307 表 34 - FUSION 资助的项目 ............................................................................................................. 307 表 35 - 与能源效率维度相一致的项目 ............................................................................................. 309 表 36 - 与脱碳相一致的项目：可再生能源 ............................................................................. 309 表 37 - 与脱碳相一致的项目：温室气体减排 ............................................................................. 311 表 38 - 与能源安全相一致的项目 ............................................................................................. 312来源：CAA。 ........................................................... 261 表 25-2010 年至 2022 年可再生能源在最终能源消费总量和各部门总消费中的占比。 来源：欧盟统计局，SHARES 工具。 ............................................................................................. 279 表 26-最终可再生能源消费，单位：GWh ............................................................................. 279 表 27-各部门一次能源和最终能源消费（不包括环境热），ktoe ............................................................................................. 285 表 28-各部门一次能源和最终能源消费（包括环境热），ktoe ............................................................................................. 285 表 29-2017 年至 2022 年按来源划分的 LNG 交付量。 来源：欧盟统计局。 .................................................................... 293 表 30-2017 年至 2022 年马耳他发电部门的天然气交付量。 来源：能源和水务服务监管机构。 ........................................................................................................... 293 表 31 - 现有马耳他-西西里电力互连器的详细信息。 .............................................................................. 295 表 32 - 2024 年清洁能源转型伙伴关系 (CETPartnership) 呼叫模块 ........................................ 306 表 33 - SINO 马耳他基金资助的项目 ............................................................................................. 307 表 34 - FUSION 资助的项目 ............................................................................................................. 307 表 35 - 与能源效率维度相一致的项目 ............................................................................................. 309 表 36 - 与脱碳相一致的项目：可再生能源 ............................................................................. 309 表 37 - 与脱碳相一致的项目：温室气体减排 ............................................................................. 311 表 38 - 与能源安全相一致的项目 ............................................................................................. 312.................. 293 表 31 - 现有马耳他-西西里电力互连器的详细信息。 .............................................................. 295 表 32 - 2024 年清洁能源转型伙伴关系 (CETPartnership) 呼叫模块 ........................................ 306 表 33 - SINO 马耳他基金资助的项目 ............................................................................................. 307 表 34 - FUSION 资助的项目 ............................................................................................................. 307 表 35 - 与能源效率维度相一致的项目 ............................................................................................. 309 表 36 - 与脱碳相一致的项目：可再生能源 ............................................................................. 309 表 37 - 与脱碳相一致的项目：温室气体减排 ............................................................................. 311 表 38 - 与能源安全相一致的项目 ............................................................................................. 312.................. 293 表 31 - 现有马耳他-西西里电力互连器的详细信息。 .............................................................. 295 表 32 - 2024 年清洁能源转型伙伴关系 (CETPartnership) 呼叫模块 ........................................ 306 表 33 - SINO 马耳他基金资助的项目 ............................................................................................. 307 表 34 - FUSION 资助的项目 ............................................................................................................. 307 表 35 - 与能源效率维度相一致的项目 ............................................................................................. 309 表 36 - 与脱碳相一致的项目：可再生能源 ............................................................................. 309 表 37 - 与脱碳相一致的项目：温室气体减排 ............................................................................. 311 表 38 - 与能源安全相一致的项目 ............................................................................................. 312
抑制剂在严重血友病中的50天后根据浓度的发展：来自欧洲血友病安全监视（EUHASS）的数据
[2]男性C，Andersson NG，Rafowicz A，Liesner R，Kurnik K，Fischer K等。抑制剂在未选择的先前未经治疗的患者B：PEDNET研究中。Hae-Matologica。 2021; 106：123 - 9。 [3] Fischer K，Iorio A，Hollingsworth R，Makris M，Euhass合作者。 FVIII抑制剂根据浓度的开发：Euhass注册中心的数据不包括与其他研究重叠。 血友病。 2016; 22：E36 - 8。 [4] Fischer K，Lassila R，Peyvandi F，Calizzani G，Gatt A，Lambert T等。 根据浓缩物的抑制剂发展：欧洲血友病安全监测（EUHASS）项目的四年结果。 血栓止血。 2015; 113：968 - 75。 [5] Gouw SC，Van der Bom JG，Ljung R，Escuriola C，Cid AR，Claeyssens- Donadel S等。 因子VIII产品和严重血友病的抑制剂发育。 2013; 368：231 - 9。 [6] Peyvandi F，Mannucci PM，Garagiola I，El-Beshlawy A，Elalfy M，Ramanan V等。 对因子VIII和中和抗体的随机试验A. N Engl J Med。 2016; 374：2054 - 64。 [7] Hassan S，Cannav o A，Gouw SC，Rosendaal FR，Van der Bom JG。 因子VIII产品和抑制剂的发育率是严重或中度严重的血友病A：一种系统综述。 J血栓止血。 2018; 16：1055 - 68。 [8] Makris M，Calizzani G，Fischer K，Gilman EA，Hay CR，Lassila R等。 螺栓res。 2011; 127：S22 - 5。Hae-Matologica。2021; 106：123 - 9。[3] Fischer K，Iorio A，Hollingsworth R，Makris M，Euhass合作者。FVIII抑制剂根据浓度的开发：Euhass注册中心的数据不包括与其他研究重叠。血友病。2016; 22：E36 - 8。 [4] Fischer K，Lassila R，Peyvandi F，Calizzani G，Gatt A，Lambert T等。 根据浓缩物的抑制剂发展：欧洲血友病安全监测（EUHASS）项目的四年结果。 血栓止血。 2015; 113：968 - 75。 [5] Gouw SC，Van der Bom JG，Ljung R，Escuriola C，Cid AR，Claeyssens- Donadel S等。 因子VIII产品和严重血友病的抑制剂发育。 2013; 368：231 - 9。 [6] Peyvandi F，Mannucci PM，Garagiola I，El-Beshlawy A，Elalfy M，Ramanan V等。 对因子VIII和中和抗体的随机试验A. 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基于 CRISPR 切口酶的软基因组编辑
摘要 Prime editing 是一种近期出现的精确基因组编辑方式，其多功能性为包括靶向基因疗法开发在内的广泛应用提供了前景。然而，其优化和使用的一个突出瓶颈是难以将大型 prime 编辑复合物递送到细胞中。在这里，我们证明将 prime 编辑构建体包装在腺病毒衣壳中可以克服这一限制，从而在转化和非转化的人类细胞中实现强大的基因组编辑，效率高达 90%。使用这种不依赖细胞周期的递送平台，我们发现 prime 编辑活动与细胞复制之间存在直接相关性，并揭示了准确的 prime 编辑事件与不需要的副产物之间的比例可能受靶细胞环境的影响。因此，腺病毒载体颗粒允许在人类细胞中有效地递送和测试 prime 编辑试剂，而与它们的转化和复制状态无关。本文整合的基因传递和基因编辑技术有望帮助研究在众多实验环境中以及最终在体外或体内治疗环境中进行主要编辑的潜力和局限性。简介基于序列可定制的向导 RNA (gRNA) 和 CRISPR 相关 (Cas) 核酸酶的可编程核酸酶是强大的基因组编辑工具 (1,2)。然而，除了脱靶诱变 (3-9) 之外，可编程核酸酶通常会因非法重组过程修复双链断裂 (DSB) 而产生复杂的靶等位基因破坏和大规模基因组重排 (10,11)。因此，最近的基因组编辑发展包括从 DNA 切割发展到基于切口 Cas 蛋白本身 (12–14) 的 DNA 非切割技术，或基于这些与 DNA 修饰部分融合的 RNA 可编程切口酶，例如碱基编辑器和最近的 prime editors (15,16)。Prime 编辑允许安装任何单个碱基对替换以及明确定义的小插入或删除，同时不需要 DSB 或供体 DNA 底物 (15)。Prime editors 由扩展的 gRNA 和 Cas9 H840A 切口酶组成，它们与工程逆转录酶 (RT) 融合，分别命名为 pegRNA 和 PE2 (补充图 S1A)。pegRNA 由 3' 端共价连接到编码目标编辑的 RT 模板和 RT 引物结合位点 (PBS) 的 gRNA 形成。位点特异性基因组 DNA 切口产生 3' 端 DNA 瓣，经 PBS 退火后，在 RNA 模板上引发 RT 介导的 DNA 合成。PE2 和 PE3。DNA 拷贝杂交至互补靶 DNA 后，编辑最终通过连续链解析反应整合到基因组中（补充图 S1B）。Prime 编辑有两种主要方式，即前者系统需要传递 PE2：pegRNA 复合物；后者依赖于这些复合物与传统 gRNA 一起转移。在 PE3 系统中，gRNA 指导的未编辑 DNA 链切口促进了使用编辑链作为修复模板（补充图 S1B）。尽管 Prime 编辑原理具有巨大的潜力和多功能性，但仍存在一些需要识别、仔细评估和解决的特定缺陷。大型的 Prime 编辑核糖核蛋白复合物由 ∼ 125 个核苷酸长的 pegRNA 和由 6.3 kb ORF 编码的 238 kDa 融合蛋白组成，这带来了巨大的生产和交付问题。事实上，生产足够数量的 >100 kDa 蛋白质尤其具有挑战性。此外，尽管病毒载体是最有效的基因组编辑工具递送系统之一 (17)，但最常用的平台基于 ∼ 15 nm 腺相关病毒 (AAV) 颗粒，由于其包装容量有限（∼ 4.7 kb）（17），不适合转移全长 Prime 编辑序列。完全病毒基因删除的腺病毒载体（也称为高容量腺病毒载体），以下称为腺载体颗粒 (AdVP)，聚集了一组有价值的特征，即； (i) 大包装容量（即高达 36 kb），(ii) 严格的游离性，(iii) 高遗传稳定性；(iv) 容易的细胞趋向性改变和 (v) 高效转导分裂和静止细胞 (17–21)。在这里，我们研究了定制这些 ∼ 90 nm 生物纳米粒子用于全长主要编辑组件的一次性转移的可行性和实用性，并且由于潜在或影响主要编辑结果的细胞过程基本上是未知的，利用后一个特性来研究细胞周期对这种位点特异性 DNA 修饰原理的作用。材料和方法 细胞
基于 CRISPR 切口酶的软基因组编辑
摘要 Prime editor 在疾病建模和再生医学方面具有巨大潜力，包括针对肌肉萎缩症杜氏肌营养不良症 (DMD) 的研究。然而，Prime 编辑系统的庞大规模和多组分性质带来了巨大的生产和交付问题。本文，我们报告将优化的全长 Prime 编辑构建体包装在腺病毒载体颗粒 (AdVP) 中，可以在人类成肌细胞（即成肌细胞和间充质干细胞）中安装精确的 DMD 编辑（分别高达 80% 和 64%）。AdVP 转导确定了优化的 Prime 编辑试剂，这些试剂能够恢复约 14% 患者基因型的 DMD 阅读框架，并恢复未选择的 DMD 肌细胞群中的肌营养不良蛋白合成和肌营养不良蛋白-β-肌营养不良聚糖连接。 AdVP 同样适用于纠正 DMD iPSC 衍生的心肌细胞，并通过靶向外显子 51 缺失提供针对 DMD 修复的双引物编辑器。此外，通过利用不依赖细胞周期的 AdVP 转导过程，我们报告 2 组分和 3 组分引物编辑模式在细胞周期中最活跃，而不是在有丝分裂后细胞中。最后，我们确定将 AdVP 转导与无缝引物编辑相结合可以通过连续的递送轮次堆叠染色体编辑。总之，AdVP 允许对高级引物编辑系统进行多种研究，而不管其大小和组分数量如何，这应该有助于它们的筛选和应用。引言由序列定制的向导 RNA (gRNA) 和 Cas9 内切酶组成的可编程核酸酶是基因组编辑的有力工具。然而，双链 DNA 断裂 (DSB) 的普遍修复是通过容易出错的末端连接过程进行的，这赋予了基于核酸酶的基因组编辑内在的高诱变特性。相比之下，prime 编辑允许在特定基因组序列上安装任何单个碱基对变化和精确的小插入或删除 (indel)，而不会形成 DSB (1)。通常，prime 编辑复合物包含与切口 Cas9 变体 (prime editor) 融合的工程逆转录酶 (RT) 和 3' 端延伸的 gRNA，称为 prime 编辑向导 RNA (pegRNA)。pegRNA 分别通过其间隔物和 RT 模板部分指示靶位点选择和感兴趣的编辑。在靶位点切口后，释放的单链 DNA 与 pegRNA 的引物结合位点 (PBS) 退火，引发 RT 介导的 RNA 模板复制为互补 DNA，在基因组位点杂交、瓣切除和 DNA 修复或复制后，导致靶向染色体编辑 (1)。prime 编辑有两种主要模式，即 PE2 和 PE3 (1)。前者的 2 组分系统仅依赖于一个引物编辑蛋白（例如 PE2）和一个 pegRNA，而后者的 3 组分系统则需要一个补充的常规 gRNA。在 PE3 中，gRNA 引导的未编辑 DNA 链切口促使其被编辑链取代，这通常会导致同源双链 DNA 编辑频率更高，尽管同时增加了插入/缺失副产物 (1)。最近，基于将 prime editor 与双 pegRNA 一起递送的多重 prime 编辑正在进一步扩大 DSB 独立的基因组编辑程序的范围。事实上，在这种情况下，一对 prime 编辑复合物协同作用以安装基因组插入、删除和/或替换，其大小远远大于通过 PE2 和 PE3 策略实现的插入、删除和/或替换 (2-7)。由于其巨大的潜力和多功能性，prime 编辑系统正在快速发展，包括改进的 prime 编辑蛋白和 pegRNA，例如 PEmax (8) 和工程 pegRNA (epegRNA) 架构 (9,10)。PEmax 构建体在其 Cas9 切口酶和 RT 部分分别整合了特定突变和密码子优化，有助于增强 prime 编辑活性 (8)。 epegRNA 具有以结构化 RNA 假结形式延伸的 3' 端（例如 tevopreQ1），可保护它们免受核酸外切降解（9,10）。尽管取得了这些重要进展，但 Prime 编辑组件的庞大尺寸造成了严重的生产和交付瓶颈，阻碍了它们最有效的测试和应用。旨在改善交付瓶颈的方法包括将 Prime 编辑器构建体拆分为亚基，这些亚基在进入细胞后原位组装束缚或未束缚的 Cas9 切口酶和 RT 部分（11-20）。此外，其他辅助方法允许通过以下方式富集 Prime 编辑的细胞级分； (i) 使用替代报告基因或药物系统分离在靶基因和可选择标记基因上共同编辑的细胞 (21-23)，或 (ii) 通过共同递送细胞 DNA 错配修复途径的显性负因子来干扰编辑的 DNA 链去除 (8,10)。尽管适用于特定环境，但这些主要编辑系统的多组分特性使其设计复杂，并且其更广泛的应用具有挑战性。PEmax 构建体分别在其 Cas9 切口酶和 RT 部分中整合了特定突变和密码子优化，这有助于增强 prime editing 活性 (8)。epegRNA 具有以结构化 RNA 假结 (例如 tevopreQ1) 形式延伸的 3' 端，可保护它们免受核酸外切降解 (9,10)。尽管取得了这些重要进展，但是 prime editing 组件的尺寸较大，造成了严重的生产和交付瓶颈，阻碍了其最有效的测试和应用。旨在改善交付瓶颈的方法包括将 prime editor 构建体拆分为亚基，当进入细胞时，亚基就地组装束缚或不受束缚的 Cas9 切口酶和 RT 部分 (11-20)。此外，其他辅助方法允许通过以下方式富集 prime 编辑的细胞级分； (i) 使用替代报告基因或药物系统分离在靶基因和可选择标记基因上共同编辑的细胞 (21-23)，或 (ii) 通过共同递送细胞 DNA 错配修复途径的显性负因子来干扰编辑的 DNA 链去除 (8,10)。尽管适用于特定环境，但这些主要编辑系统的多组分特性使其设计复杂，并且其更广泛的应用具有挑战性。PEmax 构建体分别在其 Cas9 切口酶和 RT 部分中整合了特定突变和密码子优化，这有助于增强 prime editing 活性 (8)。epegRNA 具有以结构化 RNA 假结 (例如 tevopreQ1) 形式延伸的 3' 端，可保护它们免受核酸外切降解 (9,10)。尽管取得了这些重要进展，但是 prime editing 组件的尺寸较大，造成了严重的生产和交付瓶颈，阻碍了其最有效的测试和应用。旨在改善交付瓶颈的方法包括将 prime editor 构建体拆分为亚基，当进入细胞时，亚基就地组装束缚或不受束缚的 Cas9 切口酶和 RT 部分 (11-20)。此外，其他辅助方法允许通过以下方式富集 prime 编辑的细胞级分； (i) 使用替代报告基因或药物系统分离在靶基因和可选择标记基因上共同编辑的细胞 (21-23)，或 (ii) 通过共同递送细胞 DNA 错配修复途径的显性负因子来干扰编辑的 DNA 链去除 (8,10)。尽管适用于特定环境，但这些主要编辑系统的多组分特性使其设计复杂，并且其更广泛的应用具有挑战性。