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全基因组测序和分析 - Illumina
全基因组测序和分析 - 基于 Illumina Rhabdoid (RT) Illumina 基因组板的文库构建（350-450bp 插入大小）：将 96 孔格式的 2ug 基因组 DNA 通过 Covaris E210 超声处理 30 秒进行碎裂，使用 20% 的“占空比”和 5 的“强度”。双端测序文库是按照 BC 癌症机构基因组科学中心 96 孔基因组 ~350bp-450bp 插入 Illumina 文库构建协议在 Biomek FX 机器人（Beckman-Coulter，美国）上准备的。简单来说，DNA在96孔微量滴定板中用Ampure XP SPRI 珠子纯化（每60uL DNA 40-45uL 珠子），在单一反应中分别用T4 DNA聚合酶、Klenow DNA聚合酶和T4多核苷酸激酶进行末端修复和磷酸化，然后用Ampure XP SPRI 珠子进行清理，并用Klenow片段（3'到5'外显子减去）进行3' A加尾。用Ampure XP SPRI 珠子清理后，进行picogreen定量以确定下一步接头连接反应中使用的Illumina PE接头的数量。使用 Ampure XP SPRI 珠子纯化接头连接产物，然后使用 Illumina 的 PE 索引引物组，用 Phusion DNA 聚合酶（美国赛默飞世尔科技公司）进行 PCR 扩增，循环条件为：98˚C 30 秒，然后 6 个循环，98˚C 15 秒，62˚C 30 秒，72˚C 30 秒，最后在 72˚C 延伸 5 分钟。使用 Ampure XP SPRI 珠子纯化 PCR 产物，并使用高灵敏度分析（美国珀金埃尔默公司）用 Caliper LabChip GX 检查 DNA 样本。所需大小范围的 PCR 产物经过凝胶纯化（在内部定制机器人中使用 8% PAGE 或 1.5% Metaphor 琼脂糖），并使用 Agilent DNA 1000 系列 II 检测和 Quant-iT dsDNA HS 检测试剂盒使用 Qubit 荧光计（Invitrogen）评估和量化 DNA 质量，然后稀释至 8nM。在使用 v3 化学法在 Illumina HiSeq 2000/2500 平台上生成 100bp 配对末端读数之前，通过 Quant-iT dsDNA HS 检测确认最终浓度。全基因组亚硫酸盐-Seq 文库构建和测序：使用 1-5 mg Qubit（Life Technologies，加利福尼亚州卡尔斯巴德）定量基因组 DNA 进行文库构建，如所述（Gascard 等人，2015 年）。为了追踪亚硫酸盐转化的效率，将 1 ng 未甲基化的 lambda DNA (Promega) 掺入使用 Qubit 荧光法定量的 1 µg 基因组 DNA 中，并排列在 96 孔微量滴定板中。使用 Covaris 超声处理将 DNA 剪切至 300 bp 的目标大小，并使用 DNA 连接酶和 dNTP 在 30o C 下对片段进行末端修复 30 分钟。使用 2:1 AMPure XP 珠子与样品比例纯化修复后的 DNA，并在 40 µL 洗脱缓冲液中洗脱以准备 A 尾；这涉及使用 Klenow 片段和 dATP 将腺苷添加到 DNA 片段的 3' 端，然后在 37o C 下孵育 30 分钟。用磁珠清理反应后，将胞嘧啶甲基化双端接头（5'-AmCAmCTmCTTTmCmCmCTAmCAmCGAmCGmCTmCTTmCmCGATmCT-3' 和 3'-GAGmCmCGTAAGGAmCGAmCTTGGmCGAGAAGGmCTAG-5'）在 30oC 下连接到 DNA 20 分钟，并纯化接头两侧的 DNA 片段珠。在亚硫酸盐转化之前，用 10 个 PCR 循环扩增一份文库片段，并在 Agilent Bioanalyzer 高灵敏度 DNA 芯片上进行大小测定。扩增子的长度在 200-700 bp 之间。使用 EZ Methylation-Gold 试剂盒（Zymo Research）按照制造商的方案实现甲基化接头连接的 DNA 片段的亚硫酸盐转化。五次循环
Ben Shen（沉奔）
ben shen（沉奔）化学和分子医学系自然产品发现中心教授赫伯特·沃特尼姆生物医学创新与技术研究所（Wertheim uf scripps Institute）教授，Skaggs化学与生物科学研究生院，化学与生物科学研究生院，Scripps Research 130 Scripps scripps scripps scripps Way＃3A 1 jup，3A 3A. 3A.34。@ufl.edu＆shenb@scripps.edu网站：https：//scripps.ufl.edu/profile/profile/shen-ben/＆https://npdc.rc.rc.ufl.edu/home教育1982 B.Sc.中国杭州大学化学学院，1984年 化学，中国科学院（CAS），中国，1991 Ph.D.在组织中。 化学/生物化学，俄勒冈州立大学，俄勒冈州科瓦利斯，美国，1991 - 95年，摩尔。 我们的研究集中在静脉细菌中NP生物合成的化学，生物化学和遗传学中心。 我们研究的长期目标是在分子层面了解微生物如何合成复杂的NP并利用这些知识来发现新颖的NP，以影响化学，酶学，生物学和医学。 出版物305出版物，13项发布专利和> 335个邀请在国家和国际机构/会议（http://wwwww.ncbi.nlm.nih.gov/sites/sites/sites/myncbi/myncbi/ben.ssith.1/bibli，1/bibli/42110543/public/publiccubliccultcultcultcultcultcultcultcultcultcultcultcult.dirculticcultcultcultcultcult.dircultcultcultcultcultcult.dircultcultcultcultcult.中国杭州大学化学学院，1984年化学，中国科学院（CAS），中国，1991 Ph.D.在组织中。 化学/生物化学，俄勒冈州立大学，俄勒冈州科瓦利斯，美国，1991 - 95年，摩尔。 我们的研究集中在静脉细菌中NP生物合成的化学，生物化学和遗传学中心。 我们研究的长期目标是在分子层面了解微生物如何合成复杂的NP并利用这些知识来发现新颖的NP，以影响化学，酶学，生物学和医学。 出版物305出版物，13项发布专利和> 335个邀请在国家和国际机构/会议（http://wwwww.ncbi.nlm.nih.gov/sites/sites/sites/myncbi/myncbi/ben.ssith.1/bibli，1/bibli/42110543/public/publiccubliccultcultcultcultcultcultcultcultcultcultcultcult.dirculticcultcultcultcultcult.dircultcultcultcultcultcult.dircultcultcultcultcult.化学，中国科学院（CAS），中国，1991 Ph.D.在组织中。化学/生物化学，俄勒冈州立大学，俄勒冈州科瓦利斯，美国，1991 - 95年，摩尔。我们的研究集中在静脉细菌中NP生物合成的化学，生物化学和遗传学中心。我们研究的长期目标是在分子层面了解微生物如何合成复杂的NP并利用这些知识来发现新颖的NP，以影响化学，酶学，生物学和医学。出版物305出版物，13项发布专利和> 335个邀请在国家和国际机构/会议（http://wwwww.ncbi.nlm.nih.gov/sites/sites/sites/myncbi/myncbi/ben.ssith.1/bibli，1/bibli/42110543/public/publiccubliccultcultcultcultcultcultcultcultcultcultcultcult.dirculticcultcultcultcultcult.dircultcultcultcultcultcult.dircultcultcultcultcult.The Shen lab has been recognized as one of the world leaders in: (i) genome mining of Actinobacteria to identify privileged NP scaffolds and predict NP structural novelty, (ii) genetic manipulation of the most promising biosynthetic gene clusters (BGCs) in native producers or expression of the BGCs in designer hosts to produce and isolate the new NPs for structural and functional characterizations, and (iii) investigation of the biosynthetic machinery of the new NPs to discover novel chemistry and enzymology, (iv) translation of the most promising NPs from our fundamental research as leads for drug discovery and development, focusing mainly on cancers and infectious diseases, and (v) establishment of the Actinobacterial Strain Collection and Genome Database as a community resource to promote NPs training, research, and关联的应用程序。