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World File Search SystemRNP
引言 结论 披露 结果
• 我们在此描述了离子交换色谱和内在荧光分析方法的开发，以帮助表征 RNP 复合体 • 在 gRNA：Cas 比率 ≥ 1 时，单体和二聚体 apo-gRNA 中未复合蛋白质的量达到不同的平台期。动力学建模表明二聚化影响平台期的水平，但可能不能完全解释观察到的平台期行为 • 内在蛋白质荧光光谱可以以无标记的方式探测 gRNA 复合体，并显示单体和二聚体 gRNA 之间的区别 • 了解这些非共价 RNP 复合物的结构和功能之间的关系是优化细胞编辑过程以及将这些化合物表征为治疗剂的关键
基因组编辑
比较 EnGen Spy Cas9 NLS、EnGen Spy Cas9 HF1 和其他市售高保真 Cas9 变体的引导 RNA 序列与靶 DNA 序列之间的错配容忍度。允许编码与荧光标记的 dsDNA 底物单、双或三错配的几种引导 RNA 之一与五种 Cas9 变体中的每一种形成核糖核蛋白 (RNP) 复合物。包括完全匹配的引导 RNA 作为对照。将 RNP 与底物以 2:1 的比例在 37°C 下孵育 5 分钟。通过毛细管电泳测量每个 RNP 复合物的底物裂解百分比。结果绘制为热图，白色表示无裂解，蓝色强度增加表示裂解百分比增加。每行均标明引导 RNA 序列，错配以绿色表示。 DNA 原型间隔序列为 5´ – AGAACTGGCAGAGGAGGTAG – 3´，原型间隔相邻基序 (PAM) 为 5´– TGG – 3´。EnGen Spy Cas9 HF1 显示出最高的靶向切割与平均脱靶切割比率，从而表明对错配的敏感性增加。
基因组编辑
比较 EnGen Spy Cas9 NLS、EnGen Spy Cas9 HF1 和其他市售高保真 Cas9 变体的引导 RNA 序列与靶 DNA 序列之间的错配容忍度。允许编码与荧光标记的 dsDNA 底物单、双或三错配的几种引导 RNA 之一与五种 Cas9 变体中的每一种形成核糖核蛋白 (RNP) 复合物。包括完全匹配的引导 RNA 作为对照。将 RNP 与底物以 2:1 的比例在 37°C 下孵育 5 分钟。通过毛细管电泳测量每个 RNP 复合物的底物裂解百分比。结果绘制为热图，白色表示无裂解，蓝色强度增加表示裂解百分比增加。每行均标明引导 RNA 序列，错配以绿色表示。 DNA 原型间隔序列为 5´ – AGAACTGGCAGAGGAGGTAG – 3´，原型间隔相邻基序 (PAM) 为 5´– TGG – 3´。EnGen Spy Cas9 HF1 显示出最高的靶向切割与平均脱靶切割比率，从而表明对错配的敏感性增加。
胜任的细胞
比较Engen间谍Cas9 NLS，Engen Spy Cas9 HF1的指南RNA序列和目标DNA序列之间的不匹配的耐受性，以及其他商业可用的高保真cas9变体。与荧光标记的DsDNA底物编码单个，双或三倍不匹配的几个指南RNA之一，可以与五个Cas9变体中的每一个形成核糖核蛋白（RNP）复合物。将完全匹配的导向RNA作为对照包括。将RNP与底物在37°C下以2：1的比率孵育5分钟。通过毛细管电泳测量每个RNP复合物的底物裂解百分比。的结果是作为热图的图形图形，白色代表没有裂解和蓝色强度的增加，表明裂解百分比增加。指南RNA序列在每一行中指示，并以绿色表示不匹配。DNA原始序列序列为5´ - agaactggcagagaggagggtag - 3´，而原始的邻接基序（PAM）为5´– TGG - 3´。Engen间谍Cas9 HF1通过显示出靶向裂解与平均脱靶裂解的最大比例，表现出对不匹配的敏感性提高。
基于脂质纳米粒子的核糖核蛋白递送用于体内基因组编辑
成簇的规则间隔短回文重复序列 (CRISPR) 相关 (Cas) 系统是一种通过 DNA 修复机制进行位点特异性基因破坏、修复和基因组 DNA 修饰的技术，有望成为治疗传染病和遗传疾病的基本治疗策略。对于临床应用，基于非病毒载体的 CRISPR/Cas 核糖核蛋白 (RNP) 递送非常重要，但递送效率低和缺乏实用的制造方法仍然是一个问题。我们在此报告了一种基于脂质纳米颗粒 (LNP) 的 Cas RNP 递送系统的开发，该系统基于优化设计的单链寡核苷酸 (ssODN)，可实现高效的体内基因组编辑。序列特异性 RNP-ssODN 复合物的形成被发现对于 RNP 的功能性递送很重要。此外，sgRNA 和 ssODN 之间的熔化温度 (Tm) 对体内基因敲除效率有显著影响。具有高 Tm 的 ssODN 导致有限的敲除 (KO) 活性，而接近室温的 ssODN 显示出最高的 KO 活性，这表明 RNPs 的细胞质释放非常重要。连续两次静脉注射 Tm 优化的配方分别在 DNA 和蛋白质水平上实现了约 70% 和 80% 的转甲状腺素蛋白 KO，且没有任何明显的毒性。这些发现对安全的体内 CRISPR/Cas RNP 递送技术的开发及其在基因组编辑疗法中的实际应用具有重要贡献。
ATR 升级服务
第二个 ADF 安装 85 第二个无线电高度表 86 备用高度表压力单位更改 87 陡坡进近能力 88 气象雷达 89 ETOPS 120' 能力 90 T 2 CAS 安装 91 T 3 CAS 安装 92 T 3 CAS 中 ADS-B 输出 DO-260B 激活 93 T 3 CAS 中额外呼叫激活 94 反应性风切变激活 (RWS) 95 单个 HT1000 GNSS 安装 96 带 GNSS 的 P-RNAV 97 带 GNSS 的 RNP 进近 98 ADS-B 输出 DO260（新航空电子设备套件） 99 ADS-B 输出 DO260A（传统航空电子设备） 100 ADS-B 输出 DO260B（传统航空电子设备） 101 ADS-B 输出 DO260B（新航空电子设备套件） 102 第二个 SBAS GPS 安装103 垂直导航 (VNAV) 104 垂直引导 (LPV) 的航向道性能 105 RNP AR 0.3/1 能力 106 RNP AR 0.3/0.3 能力 107 SkyLens ™ 头戴式显示器 (HDM) 108 增强型视景系统 (EVS) 109
CRISPR使用霓虹灯电穿孔对永生的细胞系编辑
该方案描述了如何将核糖核蛋白（RNP）复合物组成，这些复合物由纯化的CAS9核酸酶复制，用化学改良的合成单导剂RNA（SGRNA）复制到永生的粘附或悬浮液中。包括一个敲门选项。RNP递送是使用Thermo Fisher Neon™转染系统完成的。包括各种细胞类型的电穿孔设置的参考。化学修饰的SGRNA旨在抵抗可导致细胞死亡的外核酸和先天的细胞内免疫级联反应。Editco化学修改的合成SGRNA具有特殊的纯度，并且始终驱动高编辑频率。
基因组编辑——Alt-R™ CRISPR-Cas9 系统
图 1. Alt-RTM CRISPR-Cas9 系统核糖核蛋白的表现优于其他瞬时 CRISPR-Cas9 编辑方法。人类、小鼠或大鼠的 Alt-R CRISPR HPRT 对照 crRNA 与 Alt-R CRISPR-Cas9 tracrRNA 复合。将所得复合物与 Cas9 表达质粒、Cas9 mRNA 或 Cas9 RNP（包含与 crRNA 和 tracrRNA 预复合的 Alt-R Sp Cas9 核酸酶 3NLS）一起转染到人类 (HEK-293)、小鼠 (Hepa1- 6) 或大鼠 (RG2) 细胞系中。使用 T7EI 测定法进行的突变检测表明，Alt-R CRISPR-Cas9 RNP 的表现优于其他瞬时 Cas9 表达方法，并且与稳定表达 S. pyogenes Cas9 的参考 HEK-293–Cas9 细胞的表现相当。
基因组编辑-Alt -R为CAS12A（CPF1）超核酸酶-Net
图1。Alt-R A.S. CAS12A超蛋白在TTTV目标位点选择方面表现出卓越的性能。 DOTS代表了216个指南的等级编辑效率，该指南靶向TTTV（深色阴影）或TTTN（浅色阴影）PAM站点，并且在输送到HEK-293细胞（96个位点）和陪同下（96个位点）和陪同细胞（96个位点）和野生型CAS12A V3（绿色）V3（绿色）或Cas12a Ultra（蓝色）。 如Alt-R CRISPR-CAS12A用户指南中所指示的RNP 人类细胞使用4D-Nucleofector™System（LONZA）的RNP电穿孔。 使用NGS（Rhampseq Amplicon测序）进行电穿孔后48小时编辑效率。Alt-R A.S. CAS12A超蛋白在TTTV目标位点选择方面表现出卓越的性能。DOTS代表了216个指南的等级编辑效率，该指南靶向TTTV（深色阴影）或TTTN（浅色阴影）PAM站点，并且在输送到HEK-293细胞（96个位点）和陪同下（96个位点）和陪同细胞（96个位点）和野生型CAS12A V3（绿色）V3（绿色）或Cas12a Ultra（蓝色）。人类细胞使用4D-Nucleofector™System（LONZA）的RNP电穿孔。使用NGS（Rhampseq Amplicon测序）进行电穿孔后48小时编辑效率。编辑效率。
