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定量CAS9结合和裂解跨不同指南序列映射目标参与的景观
*均等贡献摘要：RNA引导的核酸酶Cas9已解锁了通过靶向DNA裂解和通过靶向DNA结合来使基因组扰动基因组的强大方法，但是有限的生化数据妨碍了跨不同指导序列的目标序列的定量效果，以跨不同的指导序列进行定量模型。我们提供可伸缩的，基于测序的平台，用于高通量滤波器结合和裂解，然后对90个cas9 cas9核糖核蛋白（RNP）对35,047的35,047 On-Target DNA序列进行62,444个定量结合和裂解测定。我们观察到结合和裂解功效以及特异性在RNP中有很大差异。经典研究的指南通常具有非典型的特异性。围绕目标的序列上下文会显着影响CAS9的速率； CAS9 RNP可能会隔离有助于“校对”能力的非生产性状态中的目标。最后，我们将发现提炼成可解释的生物物理模型，该模型可预测各种目标序列扰动的结合和分裂的变化。
Blue 回顾 Doc 9613 第 2 卷 - SKYbrary
背景 航空业的持续增长增加了对空域容量的需求，因此强调了对可用空域进行最佳利用的必要性。区域导航技术的应用提高了运营效率，从而推动了全球各个地区和所有飞行阶段导航应用的发展。这些应用可能会扩展为提供地面移动操作指导。必须以清晰简洁的方式定义特定航线或特定空域内导航应用的要求。这是为了确保机组人员和空中交通管制员 (ATCO) 了解机载 RNAV 或 RNP 系统的功能，以确定 RNAV 或 RNP 系统的性能是否适合特定空域要求。RNAV 和 RNP 系统的发展方式与传统的地面航线和程序类似。确定了特定的 RNAV 或 RNP 系统，并通过分析和飞行测试相结合的方式评估了其性能。对于国内运营，初始系统使用甚高频全向无线电测距 (VOR) 和测距设备 (DME) 来估计其位置；对于海上运营，则采用惯性导航系统 (INS)。这些“新”系统得到了开发、评估和认证。空域和障碍物净空标准是根据现有设备的性能制定的；要求的规范则基于现有能力。在某些情况下，有必要确定可在相关空域内运行的单个设备型号。此类规定性要求导致新 RNAV 和 RNP 系统能力的引入延迟，并增加了维持适当认证的成本。为了避免这种规定性的要求，本手册介绍了一种通过指定性能要求来定义装备要求的替代方法。这被称为基于性能的导航 (PBN)。基于性能的导航 (PBN) PBN 概念规定，飞机 RNAV 和 RNP 系统性能要求应根据准确性、完整性、连续性和功能性来定义，这些是特定空域概念背景下拟议运营所必需的。PBN 概念代表了从基于传感器的导航到基于性能的导航的转变。性能要求在导航规范中确定，导航规范还确定了可用于满足性能要求的导航传感器和设备的选择。这些导航规范的定义非常详细，可通过为各国和运营商提供具体的实施指导来促进全球协调。在 PBN 下，通用导航要求是根据运营要求定义的。然后，运营商评估可用的技术和导航服务方面的选项，这些选项可以满足要求。运营商因此有机会选择更具成本效益的选项，而不是作为运营要求的一部分强加的解决方案。只要 RNAV 或 RNP 系统提供预期的性能，技术就可以随着时间的推移而发展，而无需审查运营本身。作为国际民航组织未来工作的一部分，预计将评估满足导航规范要求的其他方法，并可能酌情将其纳入适用的导航规范中。与传感器专用方法相比，PBN 具有许多优势，可用于制定空域和障碍物清除标准，即：a) 减少了维护传感器专用路线和程序的需要及其相关成本；b) 避免了每次导航系统更新时都需要开发传感器专用操作，
Blue 回顾 Doc 9613 第 2 卷 - SKYbrary
背景 航空业的持续增长增加了对空域容量的需求，因此强调了对可用空域进行最佳利用的必要性。区域导航技术的应用提高了运营效率，从而推动了全球各个地区和所有飞行阶段导航应用的发展。这些应用可能会扩展为提供地面移动操作指导。必须以清晰简洁的方式定义特定航线或特定空域内导航应用的要求。这是为了确保机组人员和空中交通管制员 (ATCO) 了解机载 RNAV 或 RNP 系统的功能，以确定 RNAV 或 RNP 系统的性能是否适合特定空域要求。RNAV 和 RNP 系统的发展方式与传统的地面航线和程序类似。确定了特定的 RNAV 或 RNP 系统，并通过分析和飞行测试相结合的方式评估了其性能。对于国内运营，初始系统使用甚高频全向无线电测距 (VOR) 和测距设备 (DME) 来估计其位置；对于海上运营，则采用惯性导航系统 (INS)。这些“新”系统得到了开发、评估和认证。空域和障碍物净空标准是根据现有设备的性能制定的；要求的规范则基于现有能力。在某些情况下，有必要确定可在相关空域内运行的单个设备型号。此类规定性要求导致新 RNAV 和 RNP 系统能力的引入延迟，并增加了维持适当认证的成本。为了避免这种规定性的要求，本手册介绍了一种通过指定性能要求来定义装备要求的替代方法。这被称为基于性能的导航 (PBN)。基于性能的导航 (PBN) PBN 概念规定，飞机 RNAV 和 RNP 系统性能要求应根据准确性、完整性、连续性和功能性来定义，这些是特定空域概念背景下拟议运营所必需的。PBN 概念代表了从基于传感器的导航到基于性能的导航的转变。性能要求在导航规范中确定，导航规范还确定了可用于满足性能要求的导航传感器和设备的选择。这些导航规范的定义非常详细，可通过为各国和运营商提供具体的实施指导来促进全球协调。在 PBN 下，通用导航要求是根据运营要求定义的。然后，运营商评估可用的技术和导航服务方面的选项，这些选项可以满足要求。运营商因此有机会选择更具成本效益的选项，而不是作为运营要求的一部分强加的解决方案。技术可以随着时间的推移而发展，而无需审查运营本身，只要 RNAV 或 RNP 系统提供预期的性能即可。作为国际民航组织未来工作的一部分，预计将评估满足导航规范要求的其他方法，并可能酌情将其纳入适用的导航规范中。与传感器专用方法相比，PBN 具有许多优势，可用于制定空域和障碍物清除标准，即：a) 减少了维护传感器专用路线和程序的需要及其相关成本；b) 避免了每次导航系统更新时都需要开发传感器专用操作，
IDT Alt-R Sp HiFi Cas9 核酸酶 V3 (CRS-10083-FL 03/19)
图 1. Alt-R Sp HiFi Cas9 Nuclease V3 促进近野生型靶向编辑效力并显著减少脱靶位点编辑。RNP 复合物由 Alt-R Sp Cas9 Nuclease V3 或 Alt-R Sp HiFi Cas9 Nuclease V3 与靶向 EMX1 基因的 Alt-R crRNA:tracrRNA 复合物结合形成。RNP 复合物 (4 µM) 通过 Nucleofection™ 方法 (Lonza) 递送到 HEK-293 细胞中。通过下一代测序 (rhAmpSeq 扩增子测序，IDT) 测量了靶位点和 9 个已知脱靶位点处的插入/缺失形成 (在 y 轴上以对数标度表示)。
使 ipsc 衍生细胞疗法的设计成为可能...
并表征重组 MAD7 以用于我们 iPSC 基因编辑平台中的核糖核蛋白 (RNP)。我们的工艺产生的蛋白质在配制后在溶液中是均质和单体的。此外，通过生物物理和功能表征测量，蛋白质稳定性在 -8080 C 下保持 6 个月。重组产生的 MAD7 的活性在 iPSC 中多个基因座的敲除 (KO) 和同源定向修复 (HDR) 效率方面与 Cpf1 相当。我们已经生成并测试了针对基因组中不同位点的多个 gRNA，并证明 MAD7 不会引起任何结构异常，这通过正交遗传表征测定确定。数据表明，重组 MAD7 CRISPR 核酸酶可以有效表达、纯化和配制，从而能够将哺乳动物细胞稳健而精确地改造为核糖核蛋白 (RNP)。我们目前正在使用我们的 MAD7 优化工艺来生成 MAD7 RNP，以便对具有多个基因编辑的治疗性 iPSC 衍生的 NK 和 T 细胞候选产品进行基因工程改造。Hunter Hoffman、Jill M. Carton、Buddha Gurung、Justin Bianchini、Shelby Keating、Michael F. Naso、Luis Borges
通过 CRISPR-Cas9 核糖核蛋白和基于 URA3 的标记回收对炭疽菌进行有效的多基因敲除
图 1. CRISPR-Cas9 RNP 促进 C. higginsianum 中与供体 DNA 的同源重组。（a）CRISPR-Cas9 RNP 介导的 HDR 示意图。首先，将重组 Cas9 蛋白（橙色）和针对目的基因 (GOI) 的合成 gRNA（洋红色）在体外混合以形成 RNP。其次，用 RNP 和供体 DNA 转化 C. higginsianum 原生质体，其中供体 DNA 具有选择标记 NPTII，两侧是两个同源臂。最后，通过结合选择培养基和基于 PCR 的筛选来分离用选择盒替换 GOI 的菌株。（b）URA3 敲除的构建设计。供体 DNA 具有选择标记，即 NPTII 表达盒，两侧是 0.5 kb 的同源臂，以浅灰色框表示。箭头表示扩增 ura3 基因组中特异性存在的“片段 1”和“片段 2”的引物。（c）转化子数量和 URA3 敲除率。左图显示每板转化子数量，右图显示每板 URA3 敲除率（n =5）。“-gRNA”和“+gRNA”分别代表不含和含 gRNA 的结果。星号表示统计差异（p < 0.001，Welch t 检验）。通过 PCR 筛选评估 URA3 的敲除，如 (d) 所示。（d）ura3 突变体的 PCR 筛选。使用 (b) 中所示的引物组，在含有 500 µg/ml G418 的 MA 上使用每个菌落进行 PCR。显示了从 -gRNA 和 +gRNA 转化子中随机选择的七个菌落的结果。 C. higginsianum 肌动蛋白基因 (CH63R_04240) 的 238 bp 片段被指定为肌动蛋白。凝胶左侧的数字表示 DNA 大小标记 (bp) 的位置。
由 CRISPR 介导的高效靶向诱变...
CRISPR-Cas 基因组编辑技术的最新进展使得在农作物中进行定点诱变和精确基因替换成为可能。CRISPR-Cas9 和 CRISPR-Cas12a 是两种主要且应用广泛的基因组编辑系统。然而，当 CRISPR-Cas12a 编辑机制从转基因中表达时，一些染色体靶标在玉米和大豆等重要作物中的编辑频率较低。本文，我们报告了一种有效的方法，即通过粒子轰击将 Cas12a-gRNA 核糖核蛋白复合物 (RNP) 递送到优良玉米品种的未成熟玉米胚中，直接生成基因组编辑系。通过将 Cas12a RNP 基因枪递送到未成熟胚中，在再生过程中未经任何选择，获得了约 7% 频率的基因组编辑系。令人惊讶的是，当 Cas12a RNP 与 PMI 选择标记基因盒共同递送并用甘露糖选择诱导愈伤组织培养物时，基因编辑率平均提高到 60%，在某些实验中甚至高达 100%。我们还表明，使用活性更高的 Cas12a 突变体可提高更难处理的靶序列的编辑效率。本文描述的进展为玉米的遗传改良提供了有用的工具。
使用内源性 U6 snRNA 启动子驱动的 CRISPR/Cas9 sgRNA 在核盘菌中进行有效的基因组编辑
我们之前报道了一种针对死体营养真菌植物病原菌核病菌的 CRISPR-Cas9 基因组编辑系统。该系统（TrpC-sgRNA 系统）基于 RNA 聚合酶 II（RNA Pol II）启动子（TrpC）在体内驱动 sgRNA 转录，成功创建了基因插入突变体。然而，相对低效率的靶向基因编辑阻碍了该方法在核病菌功能基因组研究中的应用。为了进一步优化 CRISPR-Cas9 系统，建立并评估了无质粒的 Cas9 蛋白/sgRNA 核糖核蛋白（RNP）介导的系统（RNP 系统）和基于质粒的 RNA 聚合酶 III 启动子（U6）驱动的 sgRNA 转录系统（U6-sgRNA 系统）。本研究针对之前鉴定的草酰乙酸乙酰水解酶 (Ssoah1) 基因座和一个编码聚酮化合物合酶 12 (Sspks12) 的新基因座创建了功能丧失突变体。RNP 系统与我们之前报道的 TrpC-sgRNA 系统类似，可以在 Ssoah1 基因座上以类似的效率产生突变。然而，这两个系统都未能在 Sspks12 基因座上成功产生突变。U6-sgRNA 系统在这两个基因座上都表现出明显更高的基因突变效率。该技术为靶向基因突变提供了一种简单有效的策略，从而将加快对这种具有重要经济价值的植物病原体的致病性和发展的研究步伐。
生成自然杀手细胞具有增强功能的自然杀手细胞
CRISPR-CAS12A：群集定期间隔短的短质体重复蛋白酶12A； IHC：免疫组织化学；墨水：源自诱导多能干细胞的天然杀伤细胞； Pflow：磷酸化流式细胞仪； RNP：核糖蛋白