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通过脂质体介导将 CRISPR/Cas9 核糖核蛋白递送至原生质体，对难处理的酿酒葡萄基因型进行基因组编辑
生物技术育种方法应用于木本植物的主要瓶颈是由于几种基因型表现出的体外再生困难。另一方面，木本植物，尤其是葡萄树（Vitis vinifera L.），使用大部分农药和其他昂贵的农业投入，因此开发有效的遗传改良方法迫在眉睫。基因组编辑是一种非常有前途的技术，特别是对于酿酒葡萄基因型，因为它允许在一个步骤中修改所需的基因，保留在优良品种中选定和重视的所有品质性状。本文报道了一种用于生产无转基因葡萄植物的基因组编辑和再生方案，利用脂质转染胺介导的 CRISPR - Cas9 核糖核蛋白（RNP）直接递送以靶向八氢番茄红素去饱和酶基因。我们重点研究了内比奥罗 (V. vinifera)，这是一种极难在体外生长的葡萄酒基因型，可用来生产优质葡萄酒，例如巴罗洛和巴巴莱斯科。文献中提供的用于高度胚胎发生的葡萄树基因型的 PEG 介导的编辑方法无法使难生长的内比奥罗获得正常的胚胎发育。相反，脂质转染剂对原生质体活力和植物再生没有负面影响，转染后约 5 个月即可获得完全发育的编辑植物。我们的工作是使用脂质转染剂在植物原生质体中递送编辑试剂的首批例子之一。在酿酒葡萄基因型育种方面取得的重要成果可以扩展到其他重要的酿酒葡萄品种和难生长的木本植物。
揭示CRISPR/ ... div>的精确维修动态
图1。UMI-DSBSEQ定量单分子测序DSB和修复产品在番茄中的三个靶标。a）时间课的收集：叶肉细胞原生质体是从2-3周大的M82 Solanum Lycopersicum的幼苗中分离出来的。重复的样品在72小时内为72个时间点中的每一个中的每一个制备了200,000个原生质体。CRISPR RNP由PEG介导的转换引入。在提取RNP引入和DNA后，在0、6、12、24、36、48和72小时将样品冷冻。b）UMI-DSBSEQ目标设计：特定于目标序列的引物，与SGRNA目标序列两侧的限制酶位点结合，以创建完整分子（WT或Indel）的可用端，以连接适配器。c）UMI-DSB文库制备：从时间探索收集中提取DNA，其中包含WT（1），未经修复的DSB（2）和包含Indels（3）的完整分子，在体外受到限制，限制了确定目标切割位点的限制酶。通过填充和a添加的最终修复后，由P7 Illumina流量细胞序列和包含i7索引和9BP唯一分子标识符（UMIS）组成的Y形适配器（UMIS）与未经修复的DSB和受限端相连。通过连接介导的PCR进行的靶标特异性扩增，其中一个引物与适配器序列相同，并包含P7 Illumina Tail（橙色）和一个针对靶序列（蓝色）的引物（橙色），带有P5 Illumina Tail（红色）。这会导致SPCAS9切位点和底漆之间的DSB的单端扩增。红色X表示DSB的未捕获端。
通过 CRISPR-Cas9 核糖核蛋白和基于 URA3 的标记回收对炭疽菌进行有效的多基因敲除
图 1. CRISPR-Cas9 RNP 促进 C. higginsianum 中与供体 DNA 的同源重组。（a）CRISPR-Cas9 RNP 介导的 HDR 示意图。首先，将重组 Cas9 蛋白（橙色）和针对目的基因 (GOI) 的合成 gRNA（洋红色）在体外混合以形成 RNP。其次，用 RNP 和供体 DNA 转化 C. higginsianum 原生质体，其中供体 DNA 具有选择标记 NPTII，两侧是两个同源臂。最后，通过结合选择培养基和基于 PCR 的筛选来分离用选择盒替换 GOI 的菌株。（b）URA3 敲除的构建设计。供体 DNA 具有选择标记，即 NPTII 表达盒，两侧是 0.5 kb 的同源臂，以浅灰色框表示。箭头表示扩增 ura3 基因组中特异性存在的“片段 1”和“片段 2”的引物。（c）转化子数量和 URA3 敲除率。左图显示每板转化子数量，右图显示每板 URA3 敲除率（n =5）。“-gRNA”和“+gRNA”分别代表不含和含 gRNA 的结果。星号表示统计差异（p < 0.001，Welch t 检验）。通过 PCR 筛选评估 URA3 的敲除，如 (d) 所示。（d）ura3 突变体的 PCR 筛选。使用 (b) 中所示的引物组，在含有 500 µg/ml G418 的 MA 上使用每个菌落进行 PCR。显示了从 -gRNA 和 +gRNA 转化子中随机选择的七个菌落的结果。 C. higginsianum 肌动蛋白基因 (CH63R_04240) 的 238 bp 片段被指定为肌动蛋白。凝胶左侧的数字表示 DNA 大小标记 (bp) 的位置。
同源修复模板 DNA 链间交联增强人类细胞中的基因编辑
CRISPR–Cas9 通过产生 DNA 双链断裂 (DSB) 并随后激活细胞 DNA 修复途径实现基因编辑。根据所参与的修复途径，结果可能包括目标基因的破坏或用恢复或引入功能的新序列替换 1 。后一种基因替换事件需要传递编码新序列的模板 DNA，其水平应支持基因替换，但不会对细胞活力产生不利影响。在转化应用中，模板分子通常由病毒载体递送。虽然有效，但病毒工作流程成本高昂、难以扩大规模且对细胞有潜在毒性。因此，使用非病毒模板 DNA 是一种有吸引力的替代方案，但非病毒模板的效率和急性毒性可能不如病毒递送 2 。改进的非病毒基因编辑将成为揭示 DNA 修复机制的有力方法、有用的实验室技术和治疗多种疾病的有前途的策略 3 。一种高效的非病毒基因编辑策略是传递核糖核蛋白（RNP）制剂，包括靶向核酸酶Cas9、单向导RNA（sgRNA）和模板分子，该模板分子包含与被编辑区域以及要修改或插入的序列的同源性4。这些RNP在基因组的目标区域引入DSB，然后通过易错末端连接（EJ）过程修复断裂末端，或通过同源性定向修复（HDR）过程修复DSB，该过程使用单独模板分子1中编码的序列解决DSB（扩展数据图1a）。使用HDR将新的DNA序列引入目标位置可以实现令人兴奋的功能获得应用5。因此，增加HDR频率的策略可能会改善结果并降低实验室和生物医学工作流程的成本。
化脓性链球菌 Cas9 核糖核蛋白递送，用于在锥虫和利什曼原虫中进行高效、快速和无标记的基因编辑
图 1 布氏锥虫 PCF 中的 GFP 失活。（a）对组成性表达胞浆 eGFP 的布氏锥虫进行荧光流式细胞术分析。在用 20 μ g（无 Cas9、Cas9/gRNA GFP1、Cas9/gRNA GFP2、Cas9/gRNA GFP3）或 60 μ g（Cas9/gRNA GFP2）来自 IDT 的 RNP 复合物转染后 24 至 72 小时随时间监测 GFP 荧光，条形图显示用不同向导转染后 72 小时 GFP 阴性细胞的百分比（n = 3）。采用 Prism 软件进行统计分析，采用 t 检验（非配对、正态分布、参数检验和双尾）。显着性水平（p 值）用星号表示。 （b）上图显示了允许 e Sp Cas9 在大肠杆菌中表达的质粒的示意图。蓝色框表示蛋白质 N 端和 C 端的两个多组氨酸序列，红色框表示 TEV 和肠激酶 (EK) 蛋白酶的切割位点，灰色框表示三个核定位信号 (NLS)，黑色框表示 FLAG 表位的三个重复，橙色框表示 e Sp Cas9 编码序列。下图显示了在用来自 IDT 或实验室纯化 (Lab) 的 RNPs 复合物 (无 Cas9、20 μ g Cas9/gRNA GFP2、40 μ g Cas9/gRNA GFP2、40、60 和 80 μ g Cas9/gRNA GFP2) 转染后 72 小时监测的表达 GFP 的 T. brucei 的荧光流式细胞术分析。（c）不再表达 GFP 的克隆中 GFP 基因的一部分的序列比较。该序列仅显示 GFP2 向导 RNA 所针对的区域。灰色框（H1 和 H2）突出显示可能用于 MMEJ 修复的同源区域。由实验室纯化的 Cas9 失活产生的序列和来自商业 Cas9 的序列分别标记为 Lab 和 IDT。下面显示了 Dc6 和 Ba10 克隆的相应色谱图（置信区间 95%— p 值样式：0.1234 (ns)；0.0332 (*)；0.0021 (**)；0.0002 (***)；< 0.0001 (****)）。
基因编辑植物对非生物因子的抗性
摘要：农作物暴露于各种非生物胁迫，例如盐度，水位，极端温度，流量，辐射和金属毒性。为了克服这些挑战，育种计划试图改善方法和技术。基因编辑经常间隔间隔短的短质体重复序列（crispr/cas）是一种多功能工具，用于在中央教条的所有层中进行编辑，重点是开发抗多种生物或非生物应力的植物品种或耐受性。这项系统评价（SR）为研究CRISPR/CAS在基因编辑中的使用带来了新的贡献，以耐受植物中非生物压力的耐受性。使用搜索字符串和预定的包含和排除标准沉积在不同电子数据库中的文章。该SR表明CRISPR/CAS系统已应用于几种植物物种，以促进对主要的非生物应力的耐受性。在研究最多的农作物中是水稻和拟南芥，这是人群中的重要主食，分别是遗传学/生物技术的模型植物，以及最近的番茄，其研究数量自2021年以来有所增加。大多数研究是在亚洲进行的，在中国特别是在亚洲进行。Cas9酶用于大多数文章中，并且仅将Cas12a用作植物中的附加基因编辑工具。核糖核蛋白（RNP）已成为无DNA的基因组编辑而无需外源性DNA的策略。该SR还确定了CRISPR/CAS编辑的几个基因，并且还表明植物对应激因素的反应是由许多复杂信号途径介导的。此外，通过偏见分析的风险来验证此SR中包含的文章质量。在此SR中收集的信息有助于了解基因和非编码序列的CRISPR/CAS的当前状态，该序列在调节各种生物学过程中起着关键作用，以及对多种非生物胁迫的耐受性，具有在植物遗传改善计划中使用的潜力。
端粒酶对端粒DNA复制的作用
简介：端粒代表染色体的末端，由Ttaggg核苷酸序列的重复形成。在DNA复制过程中，DNA聚合酶酶无法转录DNA分子3´胶带的末端，这可能会导致端粒缩短。避免了端粒酶的作用，端粒酶（一种逆转录酶）能够合成DNA胶带的末端，因为它在内部有一个模制的RNA色带，正在补充端粒序列。该酶有两个亚基；具有（端粒酶的逆转录酶）和RNP（活性端粒酶的核糖核蛋白颗粒）。目标：研究的主要目的是为Rasmol软件的脚本开发2.7.4.2，以摄入代表端粒酶，RNA和端粒DNA的图像。方法论：在蛋白质数据库上进行了一项调查，以选择端粒酶上的PDB文件。从6d6v.pdb文件中开发了Rasmol软件的脚本，以演示端粒酶，RNA和端粒DNA酶结构。结果：根据为6D6V.pdb文件开发的脚本，在端粒模式以表示端粒酶表示的位置产生了图像。也可以观察到用作模具的RNA拉伸对应于CAACCC序列和其余RNA分子。还观察到三个端粒DNA序列的合成：GTTGGG。结论：通过开发的脚本，可以观察端粒酶，RNA和端粒DNA的结构，以及与霉菌一起用于生产端粒DNA序列的RNA分子区域。