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患者IPSC中的基因组编辑纠正了最普遍的USH2A突变，并揭示了有趣的突变mRNA表达曲线
遗传性视网膜营养不良（IRD）的特征是进行性光感受器变性和视力丧失。Usher综合征（USH）是一种综合征IRD，其特征是色素性视网膜炎（RP）和听力损失。USH在临床和基因上是异质的，最普遍的病因基因是USH2A。USH2A突变还解释了大量孤立的常染色体隐性RP（ARRP）病例。这种高预期是由于两个经常性的USH2A突变引起的，C.2276G> T和C.2299delg。由于USH2A cDNA的大尺寸，基因增强疗法是无法访问的。但是，CRISPR/CAS9介导的基因组编辑是可行的替代方法。我们使用了增强的链球菌链球菌（ESPCAS9）的特异性CAS9来成功实现诱导多能干细胞（IPSC）患者的两个最普遍的USH2A突变的无缝校正。我们的结果强调了促进ESPCAS9的高目标效率和特种型的功能。一致地，我们没有在校正后的IPSC中识别出任何非靶诱变，这些诱变也保留了多能性和遗传稳定性。此外，对USH2A表达的分析出乎意料地识别了与C.2276G> T和C.229999delg突变相关的异常mRNA水平，这些突变在校正后恢复。综上所述，我们有效的CRISPR/CAS9介导的USH2A突变校正策略为USH和ARRP患者提供了潜在治疗的希望。
从非合成性USH2A相关性视网膜炎的患者
众所周知，这是由于USH2A中存在“视网膜特异性”等位基因的原因。因此，出现至少一份视网膜特异性等位基因副本的患者将出现孤立的RP表型。高度复发的c.2276g> t突变是视网膜特异性等位基因（Lenassi等，2015）。在这里，我们报告了IPSC系列的生成，该患者从ARRP出现的患者和复合het erozygous c.2276g> t等位基因和另一个错位等位基因，C.7352 t> c，据我们所知，以前是未报告的。从患者皮肤活检中分离出人真皮成纤维细胞，并使用非整合性细胞调整-IPS 2.0 sendai重编程套件对重编程进行了重新编程。该套件包含仙台病毒（SEV）载体汽车，将OCT3/4，SOX2，KLF4和C-MYC转基因赋予了多脂能力。转变后三到四个星期，基于形态标准单独选择了类似IPSC的菌落。选择了Inmi005-A IPSC系列以进一步特征，因为它具有典型的IPSC菌落形态，该形态的紧密堆积的小细胞被尖锐的边界包围（图1 a）。使用逆转录（RT）-PCR确定外源载体的损失（图1 b）。通道12（p12）在SEV基因组和KLF4，KOS和C-MYC Cassettes的RT-PCR结果为阴性，类似于非转导的成纤维细胞，用作阴性对照。相比之下，被用作阳性对照的转导的成纤维细胞（纤维 + SEV）对四个靶标呈阳性。我们进行了
Prime Editors 可精确纠正与 RHO 和 USH2A 相关的视网膜色素变性中的致病突变并防止视网膜变性
视网膜色素变性 (RP) 是一组罕见的遗传性退行性眼病，影响着全球多达 150 万人。RP 是由影响视网膜的多个基因突变引起的，导致视力逐渐丧失，最终失明，症状通常在儿童时期显现，目前无法治愈。RP 的特征是双侧视杆感光细胞丧失，随后视锥感光细胞继发丧失，视网膜色素上皮 (RPE) 变性。RHO 介导的常染色体显性 RP 是由编码视紫红质的基因突变引起的，视紫红质是一种光敏 G 蛋白偶联受体，可启动视杆感光细胞中的光转导级联 (Zhen 等人，2023 年)。USH2A 基因突变是常染色体隐性 RP 和 Usher 综合征的主要原因。 USH2A 编码 usherin，这是一种跨膜蛋白，主要在视网膜的感光层、耳蜗的毛细胞和许多组织的基底膜中产生（Li et al. 2022）。
可离子网络介导SH2信号蛋白中的pH依赖性变构
对于具有生理相关的预测PK A值的可离子残基，并且数据在3D结构或2D残基相互作用网络中可视化。（b）以卡通和表面格式显示的SHP2的晶体结构（PDB ID：2SHP）。蛋白质酪氨酸磷酸酶（PTP）结构域以灰色为灰色的SH2域颜色为黄色。（c）灰色和SH2结构域的SHP2（PDB ID：2SHP）的结构（PDB ID：2SHP）在黄色的灰色和SH2结构域中的结构。通过在球体中显示的可离子网络预测管道中通过的残基。带有预测PK A位移（青色）簇的残基，具有可离子相互作用的人（洋红色）跨磷酸酶-SH2域相互作用界面的残基。（d）在47 SHP2结构（平均值±SD）上使用硅离子化网络预测管道鉴定出的青色残基的预测PK A S的表。（e）残基的残基相互作用网络具有预测的PK A Shifts（Cyan）及其可电离相互作用器（Magenta）。边缘的长度反映了库仑相互作用的强度，在PTP-SH2相互作用界面处，较强的库仑相互作用具有更短的边缘长度（F）SHP2结构的变焦。来自A和B的网络残基显示在棒子中。残基有预测的PK a在青色和洋红色中的电离相互作用者的变化。
lnk/sh2b3是少年脊髓细胞的新型驱动器...
在近90％的少年脊髓细胞性白血病（JMML）的患者中，检测到五个规范RAS途径基因（NF1，NRAS，KRAS，PTPN11和CBL）的突变，这是早期童年的致命性恶性肿瘤。在本报告中，我们描述了七名被诊断为SH2B3突变的JMML的患者，其中包括5例被发现有启动，基因功能丧失突变的患者。SH2B3编码适配器蛋白LNK，这是RAS途径上游正常出血poiesis的负调节剂。这些突变被确定为种系，体细胞或两者的组合。在其他髓样恶性肿瘤中观察到的LNK功能的丧失，由于细胞因子超敏反应和JAK/STAT信号通路的激活而导致HE Matopoietic细胞的异常增殖。在诱导多能干细胞衍生的JMML样造血祖细胞中的体外研究也表明SH2B3-MU感染了造血祖细胞对JAK抑制作用的敏感性。 最后，我们描述了两名用JAK1/2抑制剂ruxolitinib治疗的JMML和SH2B3突变的患者。 本报告扩大了JMML中启动突变的频谱，并提高了针对SH2B3突变患者的JAK/STAT途径的可能性。在诱导多能干细胞衍生的JMML样造血祖细胞中的体外研究也表明SH2B3-MU感染了造血祖细胞对JAK抑制作用的敏感性。最后，我们描述了两名用JAK1/2抑制剂ruxolitinib治疗的JMML和SH2B3突变的患者。本报告扩大了JMML中启动突变的频谱，并提高了针对SH2B3突变患者的JAK/STAT途径的可能性。
一种新型遗传病、幼年型粒单核细胞白血病和骨髓增生性肿瘤中的 SH2B3 变异
造血是人类生命周期中不断发展的高度动态过程。胎儿期和围产期是特殊的生理变化和进化时期。在这些发育阶段，体质性遗传条件可能导致维持和分化干细胞和祖细胞的有效调节剂失衡，从而导致新生儿和幼儿出现特定的血液学表型。一个突出的例子是唐氏综合征，其 21 三体性介导的胎儿造血紊乱。大约 10% 的唐氏综合征新生儿出现暂时性异常骨髓造血，其特征是外周血原始细胞增多和转录因子 GATA1 的特异性体细胞突变。1 虽然 10% 至 20% 的病例在出生后 4 年内转变为全面性白血病，但大多数病例无需治疗即可痊愈。另一种常见的发育障碍是努南综合征，该综合征由 RAS/丝裂原活化蛋白激酶 (MAPK) 通路的种系致病变异引起，可在出生后头几个月表现为暂时性骨髓增生性疾病 (MPD)。大多数努南综合征患者携带 PTPN11 种系突变。2 尽管唐氏综合征中暂时性异常髓系生成的突变情况至少已得到部分阐明，但努南综合征相关 MPD 的机制仍然很大程度上不清楚。Perez-Garcia 等人 3 和 Blombery 等人 4 报道了另一种暂时性 MPD，发生在 SH2B3 基因双等位基因种系突变的患者出生后不久。 SH2B3 编码淋巴细胞衔接子 LNK（也称为 SH2B3），是 SH2B 衔接子蛋白家族的成员，该家族还包括 APS（SH2B2）和 SH2B（SH2B1）（图 1）。SH2B 蛋白具有共同的结构，即 N 端二聚化结构域、中央 pleckstrin 同源性 (PH) 结构域和 C 端 Src 同源性
评估心脏淀粉样变性临床途径的实施：现实世界经验
USH2A突变是常染色体隐性视网膜炎色素（RP）和Usher综合征的常见原因，目前尚无批准的治疗方法。基因增强是治疗许多遗传性视网膜疾病的宝贵治疗策略；然而，常规的腺相关病毒（AAV）基因疗法无法容纳超过4.7 kb的cDNA，例如15.6 kb-kb--kb-long-long ush2a编码序列。在本研究中，我们采用了一种替代策略来成功产生支架/矩阵附着区域（S/MAR）DNA质粒载体，其中包含全长人类USH2A编码顺序，GFP记者基因，以及一个泛质启动子（CMV或CAG）（CMV或CAG），达到了大约23 kB的大小。除了在一个细胞阶段与载体显微注射，我们还评估了转染的HEK293细胞和USH2A患者衍生的皮肤纤维细胞中的载体。ps/mar-ush2a载体通过恢复usherin的患者纤维细胞中持续的转基因表达。在USH2A U507 U507斑马鱼的光感受器中拯救了usher 2复合物定位，并在光疗细胞中检测到了十二个月的GFP表达。 据我们所知，这是第一个报道的向量，可用于用功能救援表达全长Usherin。 S/MAR DNA载体已显示出有望作为一种新型的非病毒视网膜基因疗法，需要进一步的转化发展。在USH2A U507 U507斑马鱼的光感受器中拯救了usher 2复合物定位，并在光疗细胞中检测到了十二个月的GFP表达。据我们所知，这是第一个报道的向量，可用于用功能救援表达全长Usherin。 S/MAR DNA载体已显示出有望作为一种新型的非病毒视网膜基因疗法，需要进一步的转化发展。据我们所知，这是第一个报道的向量，可用于用功能救援表达全长Usherin。S/MAR DNA载体已显示出有望作为一种新型的非病毒视网膜基因疗法，需要进一步的转化发展。
在患者衍生的多能干细胞中的USH2A C.2299delg突变的产生和遗传校正
1美国迈阿密米勒大学医学院耳鼻喉科学系，美国佛罗里达州迈阿密，美国33136； zxh359@med.miami.edu（Z.H.）; ncg65@med.miami.edu（N.G。）2 John P. Hussman人类基因组学研究所，迈阿密米勒大学医学院，迈阿密，佛罗里达州33136，美国； ddykxhoorn@med.miami.edu 3迈阿密大学米勒大学医学院跨学科干细胞研究所，迈阿密，佛罗里达州佛罗里达州33136，美国4蜂窝转化研究核心，犹他大学临床与转化科学中心，犹他大学，美国盐湖城，盐湖城，盐湖城，美国犹他州84112； lillykvit@gmail.com（J.L。 ）; colin.maguire@utah.edu（c.t.m.） 5耳鼻喉科和头颈外科，以及神经科学的计划，哈佛医学院和伊顿·皮博迪实验室，马萨诸塞州的眼睛和耳朵，一级，美国马萨诸塞州波士顿，美国马萨诸塞州02114； wenliang_zhu@meei.harvard.edu 6眼科与视觉科学系，约翰·A·莫兰眼中中心，犹他大学，盐湖城，盐湖城，美国犹他州84132，美国； anna.clark@hsc.utah.edu *通信：xliu@med.miami.edu（X.L. ） ）; zheng-yi_chen@meei.harvard.edu（z.-y.c. ）; jun.yang@hsc.utah.edu（J.Y。 ）;电话。 ： +305-243-1484（X.L. ）; +617-573-3673（Z.-Y.C. ）; +801-213-2591（J.Y。 ）;传真： +305-243-2009（X.L.） †同等贡献。2 John P. Hussman人类基因组学研究所，迈阿密米勒大学医学院，迈阿密，佛罗里达州33136，美国； ddykxhoorn@med.miami.edu 3迈阿密大学米勒大学医学院跨学科干细胞研究所，迈阿密，佛罗里达州佛罗里达州33136，美国4蜂窝转化研究核心，犹他大学临床与转化科学中心，犹他大学，美国盐湖城，盐湖城，盐湖城，美国犹他州84112； lillykvit@gmail.com（J.L。）; colin.maguire@utah.edu（c.t.m.）5耳鼻喉科和头颈外科，以及神经科学的计划，哈佛医学院和伊顿·皮博迪实验室，马萨诸塞州的眼睛和耳朵，一级，美国马萨诸塞州波士顿，美国马萨诸塞州02114； wenliang_zhu@meei.harvard.edu 6眼科与视觉科学系，约翰·A·莫兰眼中中心，犹他大学，盐湖城，盐湖城，美国犹他州84132，美国； anna.clark@hsc.utah.edu *通信：xliu@med.miami.edu（X.L.）; zheng-yi_chen@meei.harvard.edu（z.-y.c.）; jun.yang@hsc.utah.edu（J.Y。）;电话。： +305-243-1484（X.L.）; +617-573-3673（Z.-Y.C.）; +801-213-2591（J.Y。）;传真： +305-243-2009（X.L.）†同等贡献。
CRISPR 基因编辑挽救了人类 USH2A 突变视网膜类器官的缺陷
• 作者要感谢所有 Editas 同事帮助规划、执行、分析和展示这项工作 • 作者非常感谢马萨诸塞州眼耳研究所 (MEEI) 的 Eric Pierce 博士和 Qi Liu 博士提供 USH2A 患者的外周血单核细胞，这些细胞以 iPSC 的形式用于本文介绍的研究 • 编辑协助由 2 the Nth（英国柴郡）的 Hilary Wong 博士提供，并由 Editas Medicine 资助
Mukherjee_ASGCT USH2A 海报_最终版
图 1：EDIT-102 的作用机制。*USH2A 基因中的 Ex13 代表导致 IRD 的任何外显子 13 突变，包括 c.2299delG。EDIT-102 编码人类 U6 启动子、向导 RNA（gRNA；RSQ9145 和 RSQ9265）、hGRK1 启动子、SV40（猿猴病毒 40）SD/SA（剪接供体/剪接受体）序列元素、NLS（核定位序列）、Sa（金黄色葡萄球菌）Cas9（CRISPR 相关蛋白 9）和 pA（多聚腺苷酸化信号）。EDIT-102 在 USH2A 外显子 13 的两侧进行编辑，导致外显子 13 从基因组和 mRNA 中去除，从而产生缺乏氨基酸 723-936 的功能性 Usherin 蛋白。