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1 TetR 型阻遏物的发散定向进化...
图 1 RolR 诱变、选择和半自动化高通量筛选工作流程。a. 全构象的 RolR 二聚体（PDB：3AQT），以及配体结合口袋的结构，其中残基 D149 为黑色，间苯二酚为青色，5Å 内选择用于诱变的 19 个残基为橙色，5Å 和 8Å 之间的残基为紫色。b. 组合活性位点饱和度测试 (CAST) 的笛卡尔结合口袋图。c. 六个氨基酸组组成了要用于诱变的 19 个残基。d. 生物传感器 TetA 双重选择的原理，使用 NiCl 2 对转录抑制能力进行负向选择，使用四环素对目标配体进行正向选择。e. 半自动化高通量筛选。在第 1 天，为每个候选分子挑选约 500 个菌落。第二天，使用声学液体处理器将 IPTG 和小分子分配到 384 孔板中。生长的菌落被稀释并分配到 384 个孔板中，使用液体处理工作站测试传感器的不同状态。第三天，荧光
2020-Small-TetR-FRET.pdf
在相关努力中，[10] 我们扩展了适用于均相 FRET 检测的分子识别元件列表，包括变构转录因子 (aTF)，这是一类特定的底物结合蛋白，可在离散蛋白质结构域中结合 DNA 和小分子效应物。在这里，我们描述了使用特征明确的 aTF TetR 进行分子识别的其他新型传感器，使用改变 aTF-DNA 结合亲和力的 aTF 变体来调节传感器灵敏度，并展示了一种带有遗传编码供体荧光团的额外传感器设计。这些额外的传感器展示了我们方法的普遍性，同时详细介绍了一种更容易被各种研究小组采用的传感器设计。变构转录因子是调节蛋白，包含 DNA 结合结构域和效应物结合结构域，能够以高特异性和选择性识别小分子。 [11] 在目标分析物存在的情况下，aTF 对其 DNA 结合序列的亲和力会受到调节，从而促进下游基因表达的阻遏物或去阻遏物调节。[11] aTF 与其同源 DNA 和效应配体之间独特但相互关联的结合提供了一种内在的转导机制，我们将其与 FRET 偶联以进行光学读出。[10] 其他先前描述的基于底物结合蛋白的 FRET 传感器通过染料标记的配体的置换（竞争性测定）或蛋白质的构象变化来实现供体-受体距离的变化。[6,7] 我们的基于 aTF 的 FRET 传感器利用供体标记的 aTF 与其受体标记的同源 DNA 序列的分析物响应性解离来引起供体-受体距离的大幅变化。因此，这些 FRET 传感器无需对配体进行染料标记，因为染料标记会改变配体的结合行为 [12]，同时能够通过供体和受体荧光团的完全解离产生显著的信号变化（图 1）。我们之所以选择 TetR 进行这项研究，是因为它是一种特性良好的 aTF，在实验室环境中广泛用于基因调控和诱导蛋白表达。[11] TetR
通过药物控制增强子基因激活......
摘要虽然对基因-增强子相互作用的调控进行了深入研究，但其应用仍然有限。在这里，我们重建了 CTCF 结合位点阵列，并设计了一种带有 tetO 的合成拓扑绝缘体用于染色质工程 (STITCH)。通过将 STITCH 与连接到 KRAB 结构域的 tetR 偶联以诱导异染色质并禁用绝缘，我们开发了一种药物诱导系统来控制增强子对基因的激活。在人类诱导多能干细胞中，插入 MYC 和增强子之间的 STITCH 下调了 MYC。STITCH 的进行性诱变导致基因-增强子相互作用的优先升级，证实了 STITCH 的强大绝缘能力。STITCH 还改变了 MYC 周围的表观遗传状态。通过药物诱导的时间过程分析发现，H3K27me3 抑制标记的沉积和去除跟随并反映表达变化，但不先于表达变化并决定表达变化。最后，插入 NEUROG2 附近的 STITCH 会削弱分化神经祖细胞中的基因激活。因此，STITCH 应该可以广泛应用于功能遗传学研究。
精确可调的，可抑制的真核转录控制器以实现遗传发现
基因的抽象条件表达和表型的观察仍然是生物学发现的核心。当前方法可启用开/关或不确定的分级基因表达。，我们开发了一个“脾气好”的控制器WTC 846，用于精确可调，分级，生长条件在酿酒酵母中基因的独立表达。受控的基因是由核酸脑抑制的强烈半合成启动子表达的，这也抑制了其自身的合成。基础表达被第二秒消除，“零”阻遏物。自动层环降低细胞对细胞的变化，同时通过化学诱导剂对蛋白质表达进行精确调整。WTC 846 allelic strains in which the controller replaced the native promoters recapitulated known null phenotypes ( CDC42, TPI1 ), exhibited novel overexpression phenotypes ( IPL1 ), showed protein dosage-dependent growth rates and morphological phenotypes ( CDC28, TOR2, PMA1 and the hitherto uncharacterized PBR1 ), and enabled cell cycle同步（CDC20）。WTC 846定义了一个“表达夹”，可以通过实验者在细胞蛋白丰度范围内调整蛋白质剂量，而设定点周围的变化有限。
通过双向启动子通过四环素共同调节两个基因活性通过双向启动子通过四环素共同调节两个基因活性
最近，我们描述了一个调节系统，该系统允许在较高的真核细胞系（1），植物（2）和动物（3,4）中严格控制单个基因活性。该系统的基本组件是（i）一个RNA聚合酶H最小启动子，放置在多个操作序列（TETO）的下游，其大肠杆菌tnjo Tetracycline抗性操纵子和（ii）TET抑制剂（TET）（TETR）和Simples Simples Simplex Virus Protein 16（vpp16（vp p p p）（ii）（ii）（ii）融合。在不存在四环素（TC）的情况下，TTA与TET算子结合以激活最小启动子的转录，而在TC存在下，它的关联并因此阻止了其转录激活。在TTA结合后，源自巨细胞病毒IE启动子（PHCMV，5）的最小启动子，并融合到七个TETO序列中，当在短暂性表达测定中进行比较时，在HELA细胞中的父启动子的明显强度达到了显着的强度（6）。TTA的高激活潜力及其结合位点在PHCMV*_1 [（1）中的排列；参见图ia]建议设计双向启动子，该设计将允许同时调节来自中心位置多个TETO序列的两个转录单元（图la）。这样的启动子对于多种实验方法应该有用。首先，它可以允许以化学计量量的两种基因产物的合成，这通常是产生异二聚体（或异源 - 寡聚）蛋白的先决条件。在这里，我们报告了双向启动子的构建（PBI-L;图第二，通过将不同效率的最小启动子融合到中心位置的TETO序列，可以在不同但定义的水平上共同调节两个基因产物。第三，通过在双向启动子的一侧整合适当的报告基因，可以通过报告基因函数来监测对不可读基因的调节。后一种可能性也可能有助于在细胞和有机水平上 - 筛选正确整合的表达单元，以控制感兴趣的基因。1a）表明，该启动子以定量方式共同调节了编码P-半乳糖苷酶和荧光素酶的两个报告基因。此外，我们描述了一个矢量系列，很容易允许将PBI-I用于各种目的。图1a所示的广义发散转录单元由基因X的双向启动子组成，然后是