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阿纳托尔家庭医学杂志
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使用TcBuster™ (TcB-M™) 转座酶实现高效...
基因组工程工具的快速发展推动了多种免疫和干细胞疗法进入临床试验，目的是产生自体和同种异体疗法。这些疗法中的许多都使用病毒载体来运送治疗货物。然而，病毒介导的疗法具有免疫原性、货物大小限制、整合位点风险、制造延迟的风险，并且成本极高。虽然有两种已知的非病毒转座酶系统 piggyBac ® 和 Sleeping Beauty ™ ，但两者都被专门授权用于细胞疗法，不能用于商业用途。TcBuster-M ™ (TcB-M ™ ) 是一种可商购的非病毒转座酶编辑平台，可克服当前的病毒限制。TcBuster 存在于赤拟谷盗中，是 hAT 转座酶家族的成员。利用定向进化，我们设计了一种高活性突变体 (TcB-M)，使用更少的 mRNA 转座酶和 Nanoplasmid ™ DNA 转座子提高了转座率。与用于构建 piggyBac 和 Sleeping Beauty 高活性酶的工程努力不同，我们在哺乳动物细胞中使用了一种新型高通量筛选平台。这使我们能够筛选一个包含 >300 万个变体的突变体库，这比用于构建 PiggyBac 或 Sleeping Beauty 的突变体库大得多。这导致构建了用于设计原代免疫细胞的最有效的转座酶系统。TcB-M 允许快速制造细胞，并且细胞制造成本有限。目前，从载体图谱到 GMP 转座子的 TcB-M 时间约为 6-8 个月。由于 TcB-M 受货物尺寸的限制较少，我们可以设计大型多顺反子转座子，以便在各种细胞类型中稳定地递送多种蛋白质，包括原代 T 细胞和 NK 细胞、间充质干细胞和诱导性多能干细胞 (iPSC)。此外，TcB-M 可以轻松与内切酶（如 CRISPR 试剂）结合，以生成组合敲除/过表达编辑细胞产物。改进的 TcB-M 使原代 T 细胞和外周血来源的 NK 细胞中的货物整合率超过 60%，而不会牺牲细胞生长或克隆优势问题。最后，我们对慢病毒、piggyBac 和 Sleeping Beauty 工程化 CAR-T 进行了直接比较，表明 TcB-M 工程化 CAR-T 具有同等或更高的整合百分比。TcB-M 还具有更安全的整合特性，因为与慢病毒相比，它更随机地整合到基因组中，而没有对活性位点的偏好。总体而言，TcB-M 是一种广泛可用、经过验证的非病毒基因编辑技术，可在多种细胞类型中递送大量或难以处理的治疗物质。TcB-M 减少了许多病毒介导的编辑障碍，从而可以更快地生成关键的治疗方法并将其推向市场。
piggyPrime：人类细胞中的高效 Prime 编辑......
基于 CRISPR-Cas9 系统的 Prime Editing（Jinek 等人，2012 年；Jinek 等人，2013 年；Ran 等人，2013 年）通过支持有针对性的插入、删除或 12 种可能的单碱基替换中的任何一种，实现基因组的精确编辑。通过 Prime Editing 进行的基因编辑既不涉及供体模板，也不涉及双链断裂（Anzalone 等人，2019 年）。Prime Editing 的这些独特属性基于 Prime Editor (PE) 的传递，该 Prime Editor 由 Cas9-逆转录酶融合蛋白（以下称为 PE2）以及 Prime Editing 向导 RNA（pegRNA）组成，后者指定基因组靶标以及要直接写入基因组的所需编辑。 Prime 编辑在治疗致病突变以及生成疾病模型（体外和体内）方面具有巨大潜力（Schene 等人，2020 年；Jang 等人，2021 年；Kim 等人，2021 年；Liu 等人，2021 年；Park 等人，2021 年；Petri 等人，2021 年；Qian 等人，2021 年）。然而，目前 Prime 编辑的使用受到低效率的挑战，导致需要耗费大量的优化和/或筛选方法才能实现令人满意的编辑效果（Liu 等人，2020 年；Schene 等人，2020 年；Chemello 等人，2021 年；Kim 等人，2021 年；Petri 等人，2021 年）。将编码传统 CRISPR 效应物（如 Cas9 和单向导 RNA）的基因盒稳定整合到哺乳动物细胞基因组中，已广泛应用于生命科学研究，包括用于生成模型细胞系和 CRISPR 筛选（Shalem 等人，2014 年；Holmgaard 等人，2017 年；Thomsen 等人，2020 年）。对于主要编辑，由于 PE2 编码序列较大（6351 bp），因此难以将 PE2 表达盒有效整合到哺乳动物细胞基因组中。由于包装能力有限，这使病毒载体的使用变得困难（Kumar 等人，2001 年），到目前为止，PE2 系统仅通过使用两个独立的慢病毒载体递送内含肽分裂 PE2 盒而整合到哺乳动物细胞基因组中（Anzalone 等人，2019 年）。这里我们介绍了 piggyPrime，这是一种非病毒单载体系统，可利用 piggyBac 转座子系统的强大整合能力，轻松高效地将所有主要编辑组件整合到人类细胞中。重要的是，DNA 转座促进的 PE2 和 pegRNA 的长期表达支持提高主要编辑水平，从而为有效转基因提供了一种新方法。
社论：植物转化
植物转化为许多基础研究提供了重要工具，例如基因功能和相互作用、蛋白质-蛋白质相互作用、发育过程的研究，以及作物改良和开发用于生产疫苗的植物生物反应器的应用。高效且可重复的转化技术不仅对转基因植物的开发至关重要，而且对瞬时基因表达研究和基因编辑等其他应用也至关重要。农杆菌于 1907 年首次被确认为冠瘿病的病原体。负责肿瘤诱导的细菌因子在 70 年代被描述：一种称为 Ti 质粒的 DNA 质粒，由 Zaenen 等人 (1974) 描述。利用转座子诱变技术分离质粒 Ti 的功能区，确定了两个主要区域：（1）Ti 质粒的一段，称为 T-DNA，它被转移到植物细胞中并整合到植物基因组中，（2）一个毒力区，它提供 T-DNA 转移所需的所有功能（详情见 Gelvin，2000 年）。通过去除负责肿瘤诱导的基因并用显性选择标记取而代之，对 Ti 质粒进行了工程改造，以产生转基因植物（Herrera-Estrella 等人，1983 年；Zambryski 等人，1983 年；De Block 等人，1984 年）。据报道，左右边界的两个重复 25 bp 序列对于 T-DNA 的转移至关重要（Wang 等人，1984 年）。在 T-DNA 整合到植物基因组的复杂过程中，有时边界 T-DNA 序列不被认为是限制性的，载体也会被整合，特别是在左边界的情况下。为了降低不需要的骨架载体 DNA 片段的整合频率，Sahab 和 Taylor 加入了多个左边界重复序列。分子分析证实，当在三种不同的转化系统中测试三重左边界时，载体序列整合减少了 2 倍，包括木薯转化。尽管第一批转基因植物是在 80 年代初产生的，但并不是所有的植物物种都像模型物种一样容易转化，尤其是一些具有经济价值的作物物种。一些植物仍然被认为难以转化或难以转化。几乎每种植物都有一种特定的转化方案，这些方案多年来一直在缓慢发展，除了已发表论文的方法论部分外，在过去的二十年里没有更新过。修改了协议以促进基因编辑等新育种技术的发展，一些最新的方法改进包括突破性进展，如使用发育调节基因和组织培养独立的基因编辑协议。本研究主题提供了一系列关于不同作物植物转化和基因编辑的最新进展的评论和原创研究文章。下面我们简要介绍原始论文和整合此研究主题的评论。玉米可能是迄今为止转基因商业性状最多的作物品种，也是许多新品种的来源。