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挽救小鼠基因破坏引起的致死表型：新策略综述
生成 KO 动物使观察整个生物体基因被破坏时的情况成为可能，并能解答各种疾病的起源和发展过程。虽然经过漫长的历程才开发出现在易于生成的模型，但如今这些动物模型的生成效率已经足够高。生成 KO 小鼠的最初两种方法是基因捕获（Gossler 等人，1989 年）和基因打靶（Mansour 等人，1988 年）。这两种方法都需要胚胎干细胞 (ESC)，产生的是嵌合小鼠，既不经济也不省时。转座子系统也是破坏小鼠基因的实用工具（Dupuy 等人，2001 年），然而，基于转座子的方法后来被证明在创建转基因动物方面非常有效（Garrels 等人，2011 年，Katter 等人，2013 年）。位点特异性核酸内切酶、TALEN、ZFN 和 CRISPR/Cas9 是基因编辑工具箱的最新成员。TALEN 和 ZFN 需要工程蛋白，而 CRISPR/Cas9 是 RNA 引导的。CRISPR/Cas9 基因编辑需要 Cas9 mRNA 或蛋白和单向导 RNA (sgRNA)，后者由反式激活 RNA 和 CRISPR RNA 组成。上述所有核酸内切酶都会在基因组中诱导位点特异性双链断裂 (DSB)，这通常是
CRISPR介导的Brugia Malayi的转染
由于这些生物的困难生物学，反向遗传学在人类丝状寄生虫中的应用滞后。最近，我们开发了一种共同培养系统，该系统允许转染Brugia Malayi的感染性幼体阶段并有效地发展为Fecund成年人。这是开发基于Piggybac Transposon的工具包的，该工具包可用于生产具有稳定整合到寄生虫基因组中的转基因序列的寄生虫。然而，PiggyBac系统通常已被基于群的常规间隔短篇小学重复序列（CRISPR）技术取代，这允许精确编辑基因组。在这里，我们报告了适应b。马来语用于CRISPR介导的敲入插入寄生虫基因组。在b的基因间区域中鉴定出合适的CRISPR插入位点。马来语基因组。修改了双重记者Piggybac载体，用插入位点的序列替换了Piggybac倒的末端重复区域。b。用合成引导RNA，修饰的质粒和cas9核酸酶转染马来语或其。将转染的寄生虫植入沙鼠中，并允许发展为成年人。后代微丝菌进行了筛选，并筛选了质粒中编码的分泌的荧光素酶报告器的表达。发现大约3％的微丝虫分泌荧光素酶；所有这些都包含插入寄生虫基因组中预期位置的转基因序列。这些数据表明CRISPR可用于修改B的基因组。使用适配器介导的PCR测定法，检查了转基因微丝菌是否存在关闭目标插入；没有发现脱靶插入。马来语，开辟了精确编辑这种重要人类丝状寄生虫的基因组的道路。
使用 CRISPR/Cas9- 改组酵母基因组...
尽管转座因子之间的同源重组可通过促进染色体重排来驱动酵母基因组进化，但其潜在机制的细节尚未完全阐明。在酿酒酵母基因组中，最常见的转座子类别是逆转录转座子 Ty1。在本文中，我们探讨了 Cas9 诱导的针对 Ty1 因子的双链断裂 (DSB) 如何在该酵母物种中产生基因组改变。在 Cas9 诱导后，我们观察到染色体重排（例如缺失、重复和易位）显著增多。此外，我们发现有丝分裂重组率升高，导致杂合性丧失。通过 Southern 分析结合短读和长读 DNA 测序，我们揭示了逆转录转座子中诱导的重组的重要特征。几乎所有的染色体重排都反映了 Ty1 元件处 DSB 的修复，这是通过非等位基因同源重组实现的；成簇的 Ty 元件是染色体重排的热点。相反，大部分（约四分之三）等位基因有丝分裂重组事件在独特序列中存在断点。我们的分析表明，后一些事件反映了 Ty 元件中产生的断端的广泛处理，这些断端延伸到独特序列中，从而导致断裂诱导的复制。最后，我们发现单倍体和二倍体菌株对用于修复双链 DNA 断裂的途径有不同的偏好。我们的研究结果表明，逆转录转座子中的 DNA 损伤在推动基因组进化方面的重要性。
来自嵌合抗原受体T细胞的临床课程
T细胞修饰，对B细胞恶性肿瘤的治疗表现出了巨大的希望。成功地将CAR-T细胞疗法转化为其他肿瘤类型（包括实体瘤）是下一个重大挑战。随着构成多种遗传修饰的第二代CAR-T细胞的领域进展，正在开发更复杂的方法和工具。病毒载体，尤其是C返回病毒和慢病毒，由于其高转导效率而被用于CAR -T细胞工程。但是，有限的遗传货物，良好的制造实践（GMP）条件下的高生产成本以及高监管要求是广泛临床翻译的障碍。为了克服这些局限性，正在临床前或临床水平探索不同的非病毒方法，包括转座子/转座酶系统以及mRNA电穿孔和非整合DNA纳米摩析器。基因组编辑工具，允许对特定基因的有效敲除和/或将汽车和/或其他转基因的站点指导整合到基因组中进行，也正在评估用于CAR-T细胞工程。在这篇综述中，我们讨论了用于产生CAR-T细胞的病毒和非病毒载体的发展，重点是它们的优势和局限性。我们还使用不同的基因工程工具讨论了从临床试验中学到的经验教训，并特别关注安全性和有效性。
弧菌降解的功能性基因组学通过弧菌降解的氧疗法揭示了对支持环境适应性的细微综合代谢贡献
弧菌物种是海洋原核生物，居住在多种生态壁ches，定居非生物和生物表面。这些细菌是全球碳循环中的重要参与者，吸收了数十亿吨的碳（和氮）代谢物。对包括几丁质酶，糖转运蛋白和修饰酶的过程的许多细菌蛋白进行了很好的研究。然而，在存在几丁质的存在下，遗传功能相互作用和主要驱动因素是主要的碳源。为了解决这个问题，我们进行了转座子测序（TN-Seq），以确定在几丁质上生长在几丁质上作为唯一碳源的颤动性溶血性突变体的遗传适应性。以及验证与几丁质代谢相关的已知颤音基因，我们的数据新确定了未分类的OPRD样进口壳质蛋白和HEXR家族转录调节剂的重要作用。此外，我们在功能上暗示了HEXR在调节副溶血性环境生存的多个生理过程中，包括碳同化和细胞生长，生物膜形成和细胞运动。在营养限制条件下，我们的数据揭示了对丝状细胞形态中HEXR的要求，这是副溶血性环境适应性的关键特征。因此，由HEXR介导的重要进口孔蛋白和基因组调节支持多个生理过程，以实现弧菌念珠菌的生长和环境适应性。
“控制者”的力量：转座子介导的重复基因向新功能化进化
自从 Barbara McClintock 博士发现第一个转座子以来，转座因子 (TE) 的普遍性和多样性逐渐被人们认识到。作为基本的遗传成分，TE 不仅通过贡献功能序列（例如，调控元件或 McClintock 博士所说的“控制者”）而且通过改组基因组序列来推动生物体的进化。在后一种方面，TE 介导的基因复制促进了新基因的产生并引起了广泛的兴趣。为了顺应这一领域的发展，我们在此尝试通过关注不同类型的 TE 产生的复制中出现的共同规则来提供 TE 介导的复制的概述。具体而言，尽管不同 TE 的转座机制差异很大，但我们发现各种 TE 介导的复制机制有三个共同特点，包括末端绕行、模板转换和复发性转座。这三个特征导致一个共同的功能结果，即 TE 介导的重复倾向于发生外显子改组和新功能化。因此，突变机制的内在特性限制了这些重复的进化轨迹。我们最后讨论了该领域的未来，包括深入描述 TE 介导的重复的复制机制和功能。版权所有 © 2023，作者。中国科学院遗传与发育生物学研究所和中国遗传学会。由 Elsevier Limited 和科学出版社出版。这是一篇根据 CC BY-NC-ND 许可协议开放获取的文章（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。
叶绿体ATP合酶生物发生需要外围茎亚基ATPF和ATPG，以及通过OPR蛋白MDE1
叶绿体ATP合酶包含质体和核遗传来源的亚基。为了研究这种复合物的协调生物发生，我们通过筛选绿色藻类衣原体中的新型ATP合酶突变体，通过筛选高光灵敏度。我们在这里报告了影响两个外围茎亚基B和B 0的突变体的表征，该突变体由ATPF和ATPG基因编码，以及三个鉴定核因子MDE1的独立突变体，这些突变体稳定叶绿体编码的ATPE mRNA所需的核因子MDE1。全基因组测序显示在ATPG的3 0 UTR中插入了转座子插入，而质谱显示在此敲低ATPG突变体中，功能性ATP合酶的一小部分积累。相反，通过CRISPR-CAS9基因编辑获得的敲除ATPG突变体，完全防止ATP合酶功能和积累，这也是在ATPF框架转移突变体中观察到的。与主要类囊体蛋白酶的FTSH1-1突变体穿越ATP合酶突变体将ATPH鉴定为FTSH底物，并表明FTSH显着促进了ATP合酶亚基的一致积累。在MDE1突变体中，不存在ATPE转录物完全阻止ATP合酶的生物发生和光合作用。使用嵌合ATPE基因营救ATPE转录本的积累，我们证明了一种新型的八度肽重复（OPR）蛋白MDE1遗传靶向ATPE 5 0 UTR。从主要内部生物生物症（〜1.5 Gy）的角度来看，将MDE1募集到其ATPE靶标招募了一个核/叶绿体相互作用的典范，这些相互作用是在最近进化的，在叶绿体的祖先中，我的cs cs cs exestor higlophyceae的祖先，〜300。
Hirschfeldia incana 的基因组序列，一种提高光合作用利用效率的十字花科新模型
光合作用是维持植物和人类生命的关键过程。提高农作物的光合能力是增加其产量的一种有吸引力的方法。虽然光合作用的核心机制在 C3 植物中高度保守，但这些机制非常灵活，允许光合特性存在相当大的多样性。这种多样性之一是在高辐照度下保持较高的光合光能利用效率，正如在少数特殊的 C3 物种中发现的那样。十字花科的一种植物 Hirschfeldia incana 就是这样一种特殊的物种，由于它易于生长，因此是研究这种性状的遗传和生理基础的绝佳模型。在这里，我们展示了 H. incana 的参考基因组，并证实了其较高的光合光能利用效率。尽管 H. incana 是十字花科中迄今为止光合速率最高的，但与其密切相关的 Brassica rapa 和 Brassica nigra 的光饱和同化率也很高。H. incana 基因组已通过大规模染色体重排、物种特异性转座子活性和重复基因的差异保留与 B. rapa 和 B. nigra 基因组广泛分化。H. incana 、B. rapa 和 B. nigra 中参与光合作用和/或光保护的重复基因在拷贝数和基因表达之间表现出正相关，这为这些物种高光合效率的潜在机制提供了线索。我们的研究表明，H. incana 基因组是研究高光合光能利用效率的进化和提高作物物种光合速率的宝贵资源。
针对纤维板层肝细胞癌中的 BCL-XL
引言纤维板层肝细胞癌 (FLC) 是一种罕见且通常是致命的青少年和青年原发性肝癌 (1, 2)。手术切除是目前 FLC 的标准治疗方法；然而，这不足以治愈局部晚期或转移性疾病患者。目前尚无被证实有效的 FLC 全身疗法，尽管目前的临床研究评估了化疗、免疫疗法和靶向疗法的各种组合的效用 (1)。FLC 是由于 19 号染色体的 1 个拷贝中缺失约 400 kB 所致，这导致 DNAJB1 的第一个外显子（热休克蛋白 40 (Hsp40)）取代了 PRKACA 的第一个外显子（蛋白激酶 A 的催化亚基）。由此产生的 DNAJB1-PRKACA 是恶性基因组中发现的唯一复发性结构重排 (3–5)。使用 CRISPR-Cas9 重建产生融合嵌合体的约 400 kB 缺失足以在小鼠模型中重现 FLC (6, 7)。此外，使用睡美人转座子直接表达嵌合体会产生 FLC 样肿瘤 (7)，这表明嵌合融合蛋白的表达，而不是其他蛋白质的缺失，是 FLC 的致癌驱动因素。目前治疗 FLC 的主流方法是基于将其归类为亚变异型肝细胞癌 (HCC) (8)。然而，FLC 与 HCC 不同，具有独特的病理学分子驱动因素和独特的组织病理学特征。此外，HCC 导向疗法尚未证明对 FLC 有效。因此，许多研究人员已开始评估 FLC 中过度表达的致癌通路，包括极光激酶 A、EGFR、mTOR 和芳香酶 (9–11)。不幸的是，针对这些途径的方法尚未证明有希望进行进一步研究（12，13）。为了找到新的有效治疗方法，我们进行了一项无偏见的
用于人类基因组的强大且多功能的阵列文库...
图 1. APPEAL 克隆。A、从载体 pYJA5 中去除氨苄青霉素抗性基因 (AmpR)。sgRNA1-4 和甲氧苄啶抗性基因 (TmpR) 与三个不同的 PCR 扩增子融合。所有元件均经过 Gibson 组装以形成 4sgRNA-pYJA5 质粒，并用甲氧苄啶筛选转化子。描绘了 4sgRNA-pYJA5 全质粒和 4sgRNA 盒的详细结构。LTR，长末端重复；Ψ，包装信号序列；PB，piggyBac 转座子元件；PuroR，嘌呤霉素抗性元件；hU6、mU6、hH1 和 h7SK 是普遍表达的 RNA 聚合酶 III 启动子；sg，sgRNA。 B、转化大肠杆菌并进行甲氧苄啶筛选后，代表性 pYJA5 限制性片段、3 片段 PCR 和 APPEAL 克隆产物的单菌落 PCR。Bbs I 消化 pYJA5 产生约 1 千碱基 (kb) 的 AmpR 元件条带和约 7.6 kb 的线性化载体条带（左）。使用相应的 sgRNA 引物进行 PCR 后，三个扩增子在琼脂糖凝胶上分别显示预期的 761、360 和 422 bp 大小（中）。使用转化细菌平板中 APPEAL 克隆产物 4sgRNA 盒两侧的引物进行单菌落 PCR 始终产生预期大小（2.2 kb，右）。 C ，8 个具有不同 4sgRNA 序列的独立 APPEAL 实验中正确、重组和突变 4sgRNA 质粒的百分比（每个实验测试 ≥22 个菌落）。D ，四个 APPEAL 实验中正确、重组和突变 4sgRNA 质粒的百分比。每个点代表一个由八个菌落组成的独立生物复制品（n=24；平均值 ± SEM）。E ，高通量格式的 APPEAL 克隆时间线（h：小时；d：天）。