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进入第三维度：3D 可重构加速设备的架构探索工具
摘要 — 最近的芯片集成工艺使多个有源芯片能够在同一封装中进行 3D 堆叠，从而提供更高的逻辑密度、更低的功耗和显著的芯片间带宽。现场可编程门阵列 (FPGA) 可以从 3D 芯片集成中受益，方法是堆叠多个同质 FPGA 结构以增加逻辑容量，或与其他异构专用集成电路 (ASIC) 集成。这开启了无数的研究问题和相互关联的设计选择。然而，我们缺乏建模这些 3D 可重构设备并定量探索其巨大设计空间所需的工具。在这项工作中，我们增强了现有的 FPGA 架构探索工具并构建了新的工具来解决这一差距，重点关注电路级结构建模、3D 集成考虑、系统级架构和计算机辅助设计 (CAD) 工具。我们通过集成升级版的 COFFE 自动晶体管尺寸调整工具来扩展 RAD-Gen 框架，该工具支持 7 nm FinFET，并为较新的工艺技术提供更精确的金属感知面积模型。我们还在 RAD-Gen 中实现了新工具，用于对 3D 架构的芯片间连接和电源分配网络进行建模。此外，我们还推出了新版多功能布局布线 (VPR) 工具，该工具可以对 3D 设备进行建模，并对其架构描述语言和布局布线引擎进行了增强。最后，我们通过对同构和异构 3D 可重构设备进行建模和评估，展示了我们增强工具的功能。
干细胞研究
转基因株系采用第二代 CRISPRa 系统，该系统携带与异源三聚体 VPR 反式激活因子融合的核酸酶缺陷型 dCas9，该异源三聚体 VPR 反式激活因子由 VP64、p65 和 RTA 结构域组成。该系统可用于解释任何所需细胞类型的内源性调控机制。使用基于 CRISPR/Cas9 的基因组编辑方法，我们以 AAVS1 人类基因组位点为目标，分别引入先前描述的 dCas9VPR-tdTomato（Schoger 等人，2020 年）和嘌呤霉素盒，这些盒受 CAG 和 EF1a 启动子的控制（图 1 A）。采用优化的核转染方案转染 LhiPSC-GR1.1 细胞。转染后，选择具有 tdTomato 表达的细胞并通过 PCR 进行基因分型（图 1B，引物结合如图 1A 所示，黑色引物仅扩增野生型 (WT) 片段；绿色引物扩增插入的构建体）。随后，扩增、分析和冷冻保存两个阳性克隆（#2 和 #3）。DNA 测序数据证实了 AAVS1 基因座中的正确和纯合敲入转基因整合（图 1C，显示为克隆#2）。PCR 结果显示，在筛选的 15 个克隆中，11 个克隆含有纯合插入（命名为 CRISPRa 细胞），1 个克隆是杂合的，3 个克隆不含有插入而是含有 WT 完整基因座（用作对照细胞）（数据未显示）。通过分析 PCR 和测序预测的前五个脱靶位点进行脱靶分析；在这些位点中均未发现任何编辑事件。对照电穿孔和非电穿孔 (参考) 系用于比较 (补充图 1A)。所有系的支原体检测均为阴性。通过基于 SNP 的核型分析和标准 G 带证明了 CRISPRa 克隆 #2 和 #3 以及对照细胞的基因组完整性。未检测到数值或结构异常的证据 (图 1D)。与核转染 (图 1Ei) 和非核转染对照相比，细胞生长和形态正常。与对照 hiPSC 相比，CRISPRa 中的 dCas9 和 tdTomato 表达证实了转基因表达，如 Western blot (补充图 1B，显示克隆 #2 和 #3) 和共聚焦显微镜 (图 1Eii，显示克隆 #2，n = 3 个不同传代) 所示。通过免疫荧光分析干性标记 OCT4 的表达（图 1 Eiii）和流式细胞术分析（显示 94.2% OCT4 和 99.9% TRA1-60 阳性细胞（图 1 Eiv）（显示克隆 #2））来评估多能性。通过在 CRISPRa 和对照系中形成胚状体 (EB) 和定向分化来测试向所有三个胚层的自发分化能力。免疫荧光分析证实了 AFP、β-III-Tu bulin 和 α-平滑肌肌动蛋白 (ACTA2) 的表达，进一步支持内胚层、外胚层和中胚层的命运（图 1 F，显示克隆 #2 和 #3）。转录水平分析表明配对盒 3 ( PAX3 ) 和微管相关蛋白 2 ( MAP2 ) 的表达表明外胚层分化；T-box 转录因子 T ( TBXT ) 表明中胚层命运，而 α-Feto-Protein ( AFP ) 表明内胚层分化（补充图 1 C，显示克隆 #2 和 #3）。我们研究了 CRISPRa 系用于研究通过定向 2D 分化产生的心肌细胞的适用性，这种分化产生了自发跳动的细胞（视频作为补充材料提供），具有强大的 α-辅肌动蛋白 2 (ACTN2) 和心脏肌钙蛋白 T (TNNT2) 心脏标志物表达（（补充图 1D，显示为克隆#2）。最后，我们通过确定与心脏肥大和代谢稳态有关的 KLF15 表达的诱导来测试 CRISPRa 系的功能。我们发现，与转染了非靶向 gRNA 的各自亲本系相比，设计用于结合 KLF15 转录起始位点 (TSS) 的 44 bp 5'-上游序列的单个指导 RNA 能够显着增强 CRISPRa 系（克隆#2 和#3）中 KLF15 的转录。对照细胞没有显示独立于转染的 gRNA 的活化（图 1G）。总之，使用完全表征的 hiPSC 系，我们生成了具有纯合靶向插入、正常核型和多能性的人类 CRISPRa 系，并显示出其激活
转录激活的神经元细胞类型工程
诱导的所需基因表达一直是揭示基因功能和调节合成生物学和治疗应用的细胞活性的重要策略。Apart from ectopically expressing additional copies of a gene by introducing their open reading frames (ORFs), methods to arti fi cially activate endogenous copies of genes have been explored, including transcription activating factors tethered to zinc fi nger proteins ( Beerli et al., 2000 ) and transcription activator-like effectors (TALE) ( Miller et al., 2011 ; Zhang et al., 2011 ; Maeder等人，2013b； Perez-Pinera等，2013b）。Originally discovered as a virus-resistance mechanism from bacteria ( Barrangou et al., 2007 ), the CRISPR-Cas system has provided ef fi cient, precise, and scalable ways to modulate expression of genes, and has been successfully adopted for targeted gene activation ( Mali et al., 2013 ; Perez-Pinera et al., 2013a ; Maeder et al., 2013a ; Cheng et al., 2013年，Tanenbaum等人，2014年；为了使用CRISPR-CAS9实现基因激活，创建了催化失活的Cas9（DCAS9），以与特定的基因组区域结合而没有能力创建双链突破（Jinek et al。，2012; Gasiunas et al。，2012; Qi et al。，2013; Qi et al。，2013; Konermann et; Konermann et al an al an eal; konermann et al。，2013; a e e，2013; i。赋予DCAS9具有诱导基因表达的能力，已经探索了不同的转录激活域的基因激活强度（图1A）。第一代CRISPRA的灵感来自锌纤维和基于故事的方法，并使用了包括VP64或P65在内的单个激活域。vp64由VP16的四个副本组成，该副本是源自单纯疱疹病毒的转录激活因子。p65是NF-κB复合物的一部分，负责免疫信号传导中的转录激活。第二代CRISPRA系统制定了不同的策略来招募不同的激活剂的多个副本，包括用于招募10或24份VP64副本的Suntag阵列到给定的基因座，VP64，P65和RTA（VPR）的串联融合到DCAS9，以及