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DNA 序列和染色质结构背景下的基因组编辑保真度
基因组编辑对于医学和研究目的都具有重要价值。未来的医学应用包括纠正与疾病相关的突变、破坏致病基因，甚至引入新基因（例如，使免疫系统对肿瘤细胞敏感）。研究应用范围从在细胞系或生物体中创建敲除/敲除，和/或引入突变，以研究特定蛋白质、通路或过程的作用，到创建人源化疾病模型。鉴于实际应用的诱人范围，人们在开发基因组编辑方法方面付出了相当大的努力也就不足为奇了。引入基因组变化的传统方式是使用自发重组，要么引入 DNA 突变，要么插入允许进一步使用重组酶（如 Cre）切除基因的序列 [参见 Sauer (2002) 的评论]。随后，锌指核酸酶 (ZFN) 和转录激活因子样效应物核酸酶 (TALEN) 的发现，使得该领域取得了长足的进步，因为它们可以在所需的基因组位置而不是随机的位置引入 DNA 断裂 [参见 Gaj 等人 (2013) 的综述]。尽管如此，基因组编辑领域最大的进步是最近发现的成簇的规律间隔回文重复 (CRISPR) 相关 (Cas) 系统 (Ishino 等人，1987 年；Jansen 等人，2002 年；Jinek 等人，2012 年；Cong 等人，2013 年；Mali 等人，2013 年)。
基因组/基因编辑工具的观点
摘要：从理论上讲，可以区分等于或超过16 bp的DNA序列的DNA序列特异性识别蛋白可能是哺乳动物基因组独有的。长期序列的核酸酶，例如天然存在的归巢核酸酶和人工设计的ZFN，TALEN和CAS9-SGRNA。与其他对应物（通过蛋白质部分识别DNA靶位点的其他对应物相比，CAS9使用单个指南RNA（SGRNA）作为DNA靶标识别的模板。由于设计和合成目标位点的SGRNA的简单性，CAS9-SGRNA已成为基因组编辑的最新工具。此外，Cas9-SgrNA的RNA引导的DNA识别活性与HNH结构域和RUVC结构域的非平均链中的核酸酶活性无关，而HNH核酸酶无核酶无效无效无效活性无效（H 840 A）和RUVC核酸酶核酸酶活性无效null null突变（识别10 A）。与SGRNA，CAS9，Cas9（D 10 A），Cas9（H 840 A）和Cas9（D 10 A，H 840 A）一起用于实现双重链断裂，互补的链断管破裂，非满足链破裂，并且分别在TARPEC上进行破裂。基于这种独特的特征，可以在靶位点内或周围引入许多工程酶活性，例如DNA甲基化，组蛋白甲基化，组蛋白乙酰化，胞苷脱氨酸，腺嘌呤脱氨基和启动引导突变。为了防止Cas9衍生物的持久表达靶向，开发了许多瞬态表达方法，包括直接递送Cas9-SgrNA核糖蛋白。生物安全问题在体内应用中是必不可少的；已经设计了包装到病毒样颗粒或细胞外囊泡中的CAS9-SGRNA，已经报道了一些体内治疗试验。
2.3.7基因组编辑和表观基因组编辑
•这是世界上所有领域的首要发展，包括在微生物中繁殖有用的菌株，农业，渔业和牲畜产品的繁殖，以及将其应用于基因治疗，通过大学机构，大型公司，大型公司，大型公司，捐赠公司之间的密切协作，可以改善研究和发展能力。许多风险投资公司，包括酥脆的治疗剂，编辑医学，内部治疗疗法和光束治疗药，正在从事农作物开发，工业能源开发和人类疾病治疗方面的尖端研究与发展。 •CRISPR/CAS9，CAS12A，CAS13以及许多与CRISPR相关的基本技术和应用技术知识产权都得到了保护。 •Talaen的高油酸大豆的生产和工业用途已经发展。 •主动促进体内和离体基因组编辑处理。 Laber先天性黑色素症，经胸蛋白淀粉样变性和镰状细胞疾病的临床试验已经开始如体内基因组编辑治疗。 •计划进行体内基础变体疗法（镰状细胞疾病）的临床试验。 •使用ZFN和CRISPR进行基因组编辑治疗的研发临床试验以及更安全的表观基因组编辑治疗正在进行中。已有30多次临床试验参加了FDA，领先的基因治疗研究。 •新型核酸检测技术（夏洛克和检测方法）已经开发出来，并正在作为新型冠状病毒中POCT的诊断剂开发。
多重基因组编辑技术将彻底改变植物生物学和作物改良
多重基因组编辑 (MGE) 技术是最近开发的多功能生物工程工具，用于高精度修改基因组中两个或多个特定 DNA 基因座。这些基因组编辑工具大大提高了在多个核苷酸水平上向目标基因组引入所需变化的可行性。特别是，基于成簇的规律间隔短回文重复序列 (CRISPR)/CRISPR 相关蛋白 (Cas) [CRISPR/Cas] 系统的 MGE 工具允许同时在一个或多个基因的多个基因座上精确地产生直接突变。MGE 正在增强植物分子生物学领域，并为彻底改变现代作物育种方法提供了能力，因为使用之前的基因组编辑工具（例如锌指核酸酶 (ZFN) 和转录激活因子样效应核酸酶 (TALEN)）几乎不可能在单碱基对水平上如此精确地编辑基因组。最近，研究人员不仅开始使用 MGE 工具来推进某些植物科学领域的基因组编辑应用，而且还试图解释和回答与植物生物学相关的基本问题。在这篇评论中，我们讨论了目前在开发和利用 MGE 工具方面取得的进展，重点介绍了 CRISPR/Cas9 发现后植物生物学的改进。此外，还介绍了涉及 CRISPR/Cas 应用以编辑多个基因座或基因的最新进展。最后，对 MGE 技术在推进作物改良计划方面的优势和重要性进行了深入分析。
重新审视 CRISPR/Cas 介导的作物改良
基因组编辑 (GE) 技术已成为一种多方面的策略，它瞬间普及了改变生物体遗传构成的机制。基于成簇的规律间隔短回文重复序列 (CRISPR) 和 CRISPR 相关 (Cas) 蛋白的基因组编辑 (CRISPR/Cas) 方法具有巨大潜力，可以有效编辑多种生物体的基因组。与巨核酸酶、锌指核酸酶 (ZFN) 和转录激活因子样效应核酸酶 (TALEN) 相比，该框架因其灵活性、多功能性和效力而更经济。序列特异性核酸酶 (SSN) 的出现允许在基因组中精确诱导双链断裂 (DSB)，从而确保通过非同源末端连接 (NHEJ) 或同源定向修复 (HDR) 途径实现所需的改变。研究人员已利用 CRISPR/Cas 介导的基因组改造对作物品种进行改造，以产生提高产量、丰富营养品质和抗逆性的理想特性。本文重点介绍了通过基于 CRISPR/Cas 的工具进行基础植物研究和作物遗传改良，在作物营养改良领域取得的最新进展。这种基因组编辑的应用有助于揭示植物的基本生物学事实，并辅以全基因组关联研究、人工智能和各种生物信息学框架，从而提供未来的模型研究及其确认。本文回顾了通过这种现代生物技术方法开发的减少“脱靶”效应和社会对基因组改造作物认可的策略。
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a 汕头大学生物系，广东汕头 515063，中国 b 汕头大学广东省海洋生物技术重点实验室，广东汕头 515063，中国 c 悉尼科技大学土木与环境工程学院，百老汇，新南威尔士州，2007，澳大利亚 关键词：CRISPR-Cas；生物燃料；代谢通量；基因调控；脱靶效应 摘要 随着合成生物学和代谢工程领域的快速发展，有可能应用以最大化产量和生产率来生成各种先进的生物燃料，以实现更可持续的生物过程并减少碳足迹。在众多的分子生物学工具中，成簇的规律间隔短回文重复序列-CRISPR 相关蛋白 (CRISPR-Cas) 技术脱颖而出，具有潜在的靶向基因组编辑能力，与锌指核酸酶 (ZFN) 和转录激活因子样效应核酸酶 (TALEN) 等前辈相比，其基因敲除和敲入系统更精确、更准确。有报道涉及用于生物燃料生产的先进微生物基因组工程工具；然而，缺乏关于基于 CRISPR-Cas 的技术在改进生物燃料生产中的全面综述，以及减少脱靶效应以确保该方法成功和安全的策略。因此，在这篇综述中，我们试图系统地评论 CRISPR-Cas 的机制及其在微生物生物燃料生产中的应用。这包括生物乙醇、生物丁醇以及其他碳氢化合物，它们依次遵循各种建议来提高靶向基因的效率。本文还讨论了可诱导的开/关基因回路在响应环境刺激时在靶向基因组编辑 (TGE) 调节中的作用，即通过最小化代谢负担和最大化发酵效率。本文考虑了相关的严格监管要求，以确保最小的脱靶切割和最大的效率，以及该技术的完全生物安全性。可以得出结论，CRISPR-Cas 技术的最新发展应该为创建微生物生物炼油厂开辟一条新途径，从而有可能提高生物燃料的生产。
昆虫基因组编辑：CRISPR 技术及其前景
摘要 ：昆虫是最大的动物群之一，由于其多样性、在农业和家庭手工业中的经济意义以及作为传粉者和各种疾病媒介的生态功能而发挥着至关重要的作用。遗传学的重大进步为许多昆虫物种的基因身份和序列提供了大量信息。这些遗传资源促进了旨在开发改良遗传性状的基因组编辑研究。昆虫不育技术（SIT）就是这样一种策略，它已有效地用于北美的螺旋蝇，并继续用于管理昆虫害虫。通过 RNA 干扰（RNAi）进行的基因沉默是模型昆虫研究中的基本基因组工具，也已应用于各种生物学研究。然而，它在害虫中的效率各不相同，限制了它的广泛使用。其他基因编辑方法包括使用锌指核酸酶 (ZFN) 和转录激活因子样效应物核酸酶 (TALEN) 诱导 DNA 中的双链断裂 (DSB)，从而刺激目标序列的非同源末端连接或同源定向修复。最近，CRISPR/Cas9（成簇的规律间隔短回文重复序列/CRISPR 相关蛋白 9）系统已迅速成为跨多个领域的变革性基因组编辑方法，包括农业、昆虫抗性管理、环境安全、人类健康和工业。本文概述了昆虫中使用的各种基因组编辑技术，特别关注尖端 CRISPR/Cas 系统的应用和未来潜力，该系统有望超越其他基因组编辑方法。
理解基因编辑平台的演变，以改善作物特质
crispr（群集定期间隔短的短质体重复序列）/CAS（CASPR相关）系统最初是作为一种基本机制，用于赋予对病毒的细菌和古细菌的适应性免疫。在过去的十年中，这已被重新用于基因组编辑工具。已经开发了涉及CRISPR/CAS平台的许多基于基因编辑的作物改进技术，或与下一代测序方法结合使用，已开发出彻底改变植物基因组编辑方法的方法。最初，CRISPR/CAS核酸酶取代了早期使用的序列特异性核酸酶（SSN），例如锌 - 纤维核核酸酶（ZFN）和转录激活剂样效应子核酸酶（Talens），以解决相关离子靶标的问题。该平台的改编导致了概念的发展，例如表观基因组编辑，基础编辑和主要编辑。表观基因组编辑采用了表观效应来操纵染色质结构，而基础编辑则使用基本编辑器来设计精确的变化以改善性状。诸如Prime编辑之类的新技术现已开发为一种“搜索和重复位置”工具，用于设计所有可能的单基础更改。由于这些可用性，基因组编辑领域已迅速发展，以发展具有改善性状的作物植物。在这篇综述中，我们介绍了CRISPR/CAS系统在各种植物物种中的基因组工程方法中的发展，以及它们对调整植物基因组和相关结果对作物改善计划的影响。
利用 CRISPR/Cas9 技术生成和鉴定转基因人类多能干细胞的流程
由于其无限的增殖潜力、整倍体状态以及向任何细胞类型分化的能力，人类多能干细胞 (hPSC)（无论是胚胎细胞还是诱导细胞）在疾病建模和生产临床应用细胞方面具有巨大潜力 [ 1 – 3 ]。尽管已经建立了来自患有各种疾病的患者的许多 hPSC 系，但是针对某些病理或罕见基因突变生成 hPSC 系仍然具有挑战性。此外，个体间的遗传异质性可能导致生物学变异，从而使系间比较困难，尤其是来自健康对照和患者的 hPSC 之间的比较 [ 4 , 5 ]。对 hPSC 进行遗传操作的能力为我们引入、修改或校正突变以及生成遗传匹配的同基因对照系提供了机会，从而建立明确的基因型-表型关联 [ 6 , 7 ]。近年来，基于位点特异性核酸酶（包括锌指核酸酶 (ZFN)、转录激活因子样效应核酸酶 (TALEN)，尤其是成簇的规律间隔短回文重复序列 (CRISPR) 系统）的技术已使 hPSC 的基因组工程变得十分灵活 [8,9]。然而，由于 hPSC 的固有特性，包括相对较差的转染效率和转染后存活率低、难以分离克隆群、优先选择和扩增非整倍体克隆以及自发细胞分化，hPSC 工程仍然具有挑战性。为了缓解这些问题，已经描述了几种用于产生各种不同诱变事件的方案 [10-14]。尽管人们投入了大量精力来改进产生转基因 hPSC 的方法程序，但只有少数研究
使用息肉素反向Hoogsteen发夹技术对点突变的基因校正
单基因疾病通常是特定基因单点突变的结果，导致非功能蛋白的产生。不同的血液疾病，例如β-丘脑贫血，镰状细胞病，遗传性球细胞增多症，fanconi贫血和血友病A和B，通常是由点突变引起的。基因编辑工具，包括Talens，ZFN或CRISPR/CAS平台，以纠正负责不同疾病的突变。然而，不依赖核酸酶活性的替代分子工具，例如形成三核苷酸及其衍生物（例如肽核酸），也证明了它们在DNA中纠正突变的能力。在这里，我们回顾了修复 - 螺肽反向Hoogsteen发夹（PPRHS）技术，该发夹可以代表该领域内的替代基因编辑工具。修复-PPRHS是由由五甲状腺素桥连接的两个息肉素镜重复序列形成的单链DNA分子，然后在分子的一端进行扩展序列，该序列是与DNA序列同源的，但要修复了DNA序列，但含有修复的DNA序列。PPRH的两个息肉臂由嘌呤之间的分子内反间隔键结合，从而形成了发夹结构。该发夹芯与watson-crick键以序列特异性方式与dsDNA中靶突变相对近乎近距离突变结合，从而产生了刺激重组的三重结构。这项技术已成功地用于修复其内源性基因座中DHFR和APRT基因突变体在哺乳动物细胞中的集合，并且可以适合校正负责血液疾病的突变。