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肿瘤免疫学 CRISPR 筛选
1 耶鲁大学医学院遗传学系，美国康涅狄格州纽黑文 2 耶鲁大学系统生物学研究所，美国康涅狄格州西黑文 3 耶鲁大学癌症系统生物学中心，美国康涅狄格州西黑文 4 耶鲁大学免疫生物学项目，美国康涅狄格州纽黑文 5 耶鲁大学免疫生物学系，美国康涅狄格州纽黑文 6 耶鲁大学医学博士 – 博士学位项目，美国康涅狄格州西黑文 7 耶鲁大学分子细胞生物学、遗传学和发展项目，美国康涅狄格州纽黑文 8 耶鲁大学医学院神经外科系，美国康涅狄格州纽黑文 9 耶鲁大学医学院耶鲁综合癌症中心，美国康涅狄格州纽黑文 10 耶鲁大学医学院耶鲁干细胞中心，美国康涅狄格州纽黑文 11 耶鲁大学医学院耶鲁生物医学数据科学中心，美国康涅狄格州纽黑文
CRISPR/Cas9 基因编辑
CRISPR/Cas9 基因编辑技术自 2012 年开发以来，席卷了科学界。CRISPR/Cas 系统于 1987 年首次发现，是古菌和细菌中的一种适应性免疫反应，可抵御入侵的噬菌体和质粒。CRISPR/Cas9 基因编辑技术修改了这种免疫反应，使其在真核细胞中作为一种高度特异性的 RNA 引导复合物发挥作用，可以编辑几乎任何基因靶标。该技术可应用于所有生物学领域，包括植物病理学。然而，它在森林病理学中的应用例子基本上不存在。本综述旨在让研究人员更深入地了解天然的 CRISPR/Cas 系统，以及它们如何适应当今植物病理学中使用的 CRISPR/Cas9 技术——这些信息对于旨在将该技术应用于所研究病理系统的研究人员至关重要。我们回顾了 CRISPR/Cas9 在植物病理学中的当前应用，并提出了该技术目前尚未充分利用的森林病理系统研究的未来方向。
CRISPR 人工剪接因子。
剪接是去除前 mRNA 片段（称为内含子）同时将片段（称为外显子）连接在一起形成成熟 mRNA 的过程 1 。可变剪接是一种现象，其中基因的不同外显子片段剪接在一起形成具有不同序列的成熟 mRNA，大大扩展了单个基因编码的蛋白质库。可变剪接过程深深嵌入基因调控网络中，并控制 90% 以上的人类基因的基因异构体表达 2 。鉴于其普遍性，RNA 剪接失调与许多疾病有关也就不足为奇了 3 – 5 。RNA 测序是一种强大的工具，可用于“读取”转录组并识别不同细胞类型、条件和疾病中可变剪接的变化 2、5、6。但是，缺乏一种可扩展的工具来精确且可逆地“编写”可变剪接。尽管针对特定基因异构体进行降解的异构体特异性 RNAi 或异构体特异性 cDNA 过表达可用于扰乱异构体水平 7、8，但可能无法保持靶基因的整体表达水平。虽然剪接转换反义寡核苷酸 (ASO) 可有效扰乱剪接，甚至已进入临床试验 9，但它们的成本对于大规模研究而言过高，并且需要筛选许多设计以确定有效的靶序列。此外，由于 ASO 本质上是瞬时的，因此它们不适用于需要稳定或可诱导表达的用例。RNA 调节蛋白与异源 RNA 结合结构域的融合，例如 Pumilio/PUF、MS2 外壳蛋白 (MCP)、PP7 外壳蛋白 (PCP) 和 λ N，已经允许人工调节 RNA 过程 10 – 15。例如，通过工程化的 PUF 结构域将富含丝氨酸或富含甘氨酸的结构域束缚到外显子上，分别诱导它们的包含或排除12。然而，这些人工 RNA 效应分子需要蛋白质工程或在靶 RNA 中插入人工标签，并且依赖于短识别序列，这限制了靶向灵活性和特异性。遗传学和表观遗传学领域极大地受益于基于 RNA 引导的 DNA 靶向 CRISPR-Cas 系统的技术的爆炸式增长 16。我们，以及其他一些人，已经成功地实施了分子工具来修改目标 DNA 位点的遗传序列或表观遗传状态 17-25。CRISPR 介导的 DNA 水平基因编辑方法已被用于扰乱剪接（在剪接位点进行碱基编辑/插入缺失或切除整个外显子）19-21。然而，由于共享同一 DNA 片段的 DNA 顺式调控元件（例如转录因子结合位点）可能受到干扰，因此这些方法可能会产生混淆效应。此外，使用 CRISPR 介导的 DNA 缺失或突变方法很难促进外显子的插入。首次证明了使用 CRISPR 靶向 RNA 的激动人心的前景，即将最常用的 DNA 靶向 SpCas9 转化为 RNA 核酸酶“ RCas9 ”，并添加了 PAMmer - 一种寡核苷酸，当与靶 RNA 结合时，会模拟 SpCas9 结合所需的原型间隔区相邻基序 (PAM) 19 。虽然将 RCas9 靶向重复序列不需要 PAMmer 26 ，但重复序列仅占所有 RNA 顺式调控元件的一小部分。继 RCas9 首次报道之后，其他 CRISPR/Cas9 系统也被发现可在体外与单链 RNA 结合 27 、 28 ，但缺乏它们在哺乳动物细胞中体内 RNA 结合的证据。最近发现了来自细菌 CRISPR 系统的 RNA 引导的 RNA 核酸酶 29 – 31 。它们对哺乳动物细胞的适应不仅允许可编程的 RNA 降解 29、31、32，而且还可用于设计新功能，例如 RNA 序列编辑 30、活细胞 RNA 成像 32 和诊断 33。特别是，CasRx 是从 Ruminococcus flavefaciens 中分离出来的最近鉴定出的 IV-D 型 CRISPR-Cas 核糖核酸酶
知识树上的 CRISPR 苹果
摘要。科学时代宗教研究所 (IRAS) 邀请了著名神学家和生物伦理学家 Ted Peters（过去几十年来一直处于克隆和干细胞辩论的前沿）和我（分子生物学家）邀请各个领域的学者集思广益，探讨 CRISPR 革命的宗教和伦理影响。我们邀请了主题演讲者（本文将介绍他们的演讲），以及其他演讲者和海报展示。2019 年夏天，在美丽的星岛，会议还举办了问答会、牧师会议和为期一周的讨论。本文旨在重点介绍和抽样该会议的讨论和演讲。我将把它们分为三个广泛的主题：科学、伦理和宗教中的 CRISPR。对于不熟悉 CRISPR 技术的读者，本概述也可以作为该领域的介绍，以及未来 CRISPR 讨论想法的垫脚石。
CRISPR/Cas9 敲除质粒
CRISPR/Cas 系统是一种适应性免疫防御机制，古细菌和细菌利用该系统降解外来遗传物质。在这些生物体中，噬菌体的外来遗传物质被获取并整合到 CRISPR 基因座中 (1,2)。这种新物质也称为间隔物，可产生序列特异性片段，用于未来抵抗噬菌体感染。这些序列特异性片段被翻译成短 CRISPR RNA (crRNA)，并通过 CRISPR 相关 (Cas) 蛋白的核酸酶活性引导互补入侵 DNA 的切割，该蛋白也由 CRISPR 基因座编码 (1,2)。II 型 CRISPR 系统的 Cas9 核酸酶具有 RNA 结合域、α 螺旋识别叶 (REC)、包括用于 DNA 切割的 RuvC 和 HNH 的核酸酶叶以及原间隔物相邻基序 (PAM) 相互作用位点 (1,2)。 crRNA 通过与 REC 叶内的桥螺旋结合与 Cas9 核酸酶形成复合物，并与 crRNA 的骨架形成多个盐桥 (1,2,3)。
CRISPR 在肌肉骨骼研究中的应用
使用成簇的规律间隔短回文重复序列 (CRISPR) 系统在核苷酸水平上编辑 DNA 的能力是一种相对较新的研究工具，它正在彻底改变人类健康和疾病（包括骨科疾病）许多方面的分析。CRISPR 是从细菌防御系统改编而来，用于哺乳动物细胞基因组编辑，已被证明是一种灵活、可编程、可扩展且易于使用的基因编辑工具。最近的改进通过设计 CRISPR 系统的特定元素、发现新的天然 CRISPR 分子以及使 CRISPR 超越基因编辑到调节基因转录和操纵 RNA 的修改，提高了 CRISPR 的功能。本文将回顾 CRISPR 基因组编辑的基础知识，包括它如何改变分子肌肉骨骼研究的某些方面的描述，并将通过推测 CRISPR 相关治疗和疗法在临床骨科实践中的应用前景来结束。
CRISPR 作物：农业的未来
玉米：美国人熟知并喜爱的作物……或者至少我们是这么认为的。现代玉米看起来与其原始形态——一种名为大刍草的野草——如此不同，你很难认识到这两种植物有关联。经过数千年的定向进化，大刍草的小穗和难以消化的谷粒进化成了玉蜀黍的大穗，每个穗上有多达 500 颗多汁的谷粒（图 1）。1 玉米只是人类主导植物进化的一个例子；自文明开始以来，我们就一直在驯化和栽培农作物品种。虽然用于选择性育种植物的技术随着时间的推移而变得越来越先进，但基本原理仍然是一样的——利用物种中现有的变异来增加我们认为“理想”性状的流行率，比如玉米的穗更大。从历史上看，这是通过连续的育种实现的；今天，借助强大的基因组编辑工具，我们能够用更少的时间和精力获得相同（甚至更显著）的结果。
CRISPR小册子：嫩刀片
Bishoff Nadja，Wimberer Sandra，Gu Antonio Carusillo，Itg Minyan Li，Ucph Sevim，MDC，End
控制和增强CRISPR系统
许多细菌和古细菌的生物使用CRISPR-CAS（聚集的定期散布的短圆柱式重复 - crispr相关）系统来捍卫自己免受移动遗传元件的侵害。这些CRISPR-CAS系统根据其组成和机制分为六种类型。CRISPR-CAS酶被广泛用于基因组编辑，并为治疗遗传疾病提供了巨大的治疗机会。为了实现其全部潜力，控制CRISPR-CAS酶活性的时间，持续时间，效率和特异性很重要。在这篇综述中，我们讨论了通过改变酶功能来增强或抑制CRISPR-CAS免疫的天然CRISPR-CAS调节生物分子的机制。我们还讨论了这些CRISPR监管机构的潜在应用，并突出了有关其发展性质和目的的未解决问题。