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剪接是去除前 mRNA 片段（称为内含子）同时将片段（称为外显子）连接在一起形成成熟 mRNA 的过程 1 。可变剪接是一种现象，其中基因的不同外显子片段剪接在一起形成具有不同序列的成熟 mRNA，大大扩展了单个基因编码的蛋白质库。可变剪接过程深深嵌入基因调控网络中，并控制 90% 以上的人类基因的基因异构体表达 2 。鉴于其普遍性，RNA 剪接失调与许多疾病有关也就不足为奇了 3 – 5 。RNA 测序是一种强大的工具，可用于“读取”转录组并识别不同细胞类型、条件和疾病中可变剪接的变化 2、5、6。但是，缺乏一种可扩展的工具来精确且可逆地“编写”可变剪接。尽管针对特定基因异构体进行降解的异构体特异性 RNAi 或异构体特异性 cDNA 过表达可用于扰乱异构体水平 7、8，但可能无法保持靶基因的整体表达水平。虽然剪接转换反义寡核苷酸 (ASO) 可有效扰乱剪接，甚至已进入临床试验 9，但它们的成本对于大规模研究而言过高，并且需要筛选许多设计以确定有效的靶序列。此外，由于 ASO 本质上是瞬时的，因此它们不适用于需要稳定或可诱导表达的用例。RNA 调节蛋白与异源 RNA 结合结构域的融合，例如 Pumilio/PUF、MS2 外壳蛋白 (MCP)、PP7 外壳蛋白 (PCP) 和 λ N，已经允许人工调节 RNA 过程 10 – 15。例如，通过工程化的 PUF 结构域将富含丝氨酸或富含甘氨酸的结构域束缚到外显子上，分别诱导它们的包含或排除12。然而，这些人工 RNA 效应分子需要蛋白质工程或在靶 RNA 中插入人工标签，并且依赖于短识别序列，这限制了靶向灵活性和特异性。遗传学和表观遗传学领域极大地受益于基于 RNA 引导的 DNA 靶向 CRISPR-Cas 系统的技术的爆炸式增长 16。我们，以及其他一些人，已经成功地实施了分子工具来修改目标 DNA 位点的遗传序列或表观遗传状态 17-25。CRISPR 介导的 DNA 水平基因编辑方法已被用于扰乱剪接（在剪接位点进行碱基编辑/插入缺失或切除整个外显子）19-21。然而，由于共享同一 DNA 片段的 DNA 顺式调控元件（例如转录因子结合位点）可能受到干扰，因此这些方法可能会产生混淆效应。此外，使用 CRISPR 介导的 DNA 缺失或突变方法很难促进外显子的插入。首次证明了使用 CRISPR 靶向 RNA 的激动人心的前景，即将最常用的 DNA 靶向 SpCas9 转化为 RNA 核酸酶“ RCas9 ”，并添加了 PAMmer - 一种寡核苷酸，当与靶 RNA 结合时，会模拟 SpCas9 结合所需的原型间隔区相邻基序 (PAM) 19 。虽然将 RCas9 靶向重复序列不需要 PAMmer 26 ，但重复序列仅占所有 RNA 顺式调控元件的一小部分。继 RCas9 首次报道之后，其他 CRISPR/Cas9 系统也被发现可在体外与单链 RNA 结合 27 、 28 ，但缺乏它们在哺乳动物细胞中体内 RNA 结合的证据。最近发现了来自细菌 CRISPR 系统的 RNA 引导的 RNA 核酸酶 29 – 31 。它们对哺乳动物细胞的适应不仅允许可编程的 RNA 降解 29、31、32，而且还可用于设计新功能，例如 RNA 序列编辑 30、活细胞 RNA 成像 32 和诊断 33。特别是，CasRx 是从 Ruminococcus flavefaciens 中分离出来的最近鉴定出的 IV-D 型 CRISPR-Cas 核糖核酸酶
CRISPR 人工剪接因子。
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