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Bio-Scan V2：基于CRISPR/ DCAS9的横向流量测定... div>
需要快速，特定和可靠的诊断策略来开发用于小分子检测的敏感生物传感器，这可能有助于控制污染和疾病传播。最近，利用了目标诱导的CAS核酸酶的侧支活性[定期插入的短篇小语重复序列（CRISPR）相关的核酸酶]来开发用于检测核酸和小分子的高吞吐量诊断模块。在这里，我们通过开发Bio-Scan V2来扩展CRISPR-CAS系统的诊断能力，这是一个用于检测非核酸小分子靶标的配体反应性CRISPR-CAS平台。生物扫描V2由工程化的配体反应SGRNA（LIGRNA），生物素化死亡CAS9（DCAS9- Biotin），6-羧基流氟氨基酶（FAM） - 标记的扩增子和侧面流量测定（LFA）strips。ligrna仅在sgrna-特异性配体分子的存在下与DCAS9-biotin相互作用以形成核糖核蛋白（RNP）。接下来，将配体诱导的核糖核蛋白暴露于被标记的扩增子进行结合，并检测到配体（小分子）的存在为视觉信号[（DCAS9-biotin） - ligrna-fam-fam标记的DNA-aunp Complection]在侧面效果的测试线上。使用Bio-Scan V2平台，我们能够在短时间内以高达2μm的检测限（LOD）检测模型分子Theophiphline，只需15分钟即可从样本应用到视觉读数。在一起，生物扫描V2分析为茶碱提供了快速，特定和超敏感的检测平台。
使用 dCas9-SSAP 编辑器进行长序列基因组敲入的分步方案
请参阅相关出版物和图 2 了解模板设计示例。我们建议使用在插入/替换序列（模板的编辑部分）两端至少有 200bp 同源臂的 dsDNA 模板。我们建议将模板克隆到简单的质粒中
KRAB-dCas9 + DNMT3 和 Ezh2-dCas9 + DNMT3 命中并逃逸表观基因组编辑的可遗传基因沉默决定因素
精准表观基因组编辑作为一种在不改变遗传信息的情况下调节基因表达的方法，已引起广泛关注。然而，一个主要的限制因素是基因表达变化往往是暂时的，不像自然界中经常发生的终生表观遗传变化。在这里，我们系统地探究了基于 CRISPR / dCas9 的表观基因组编辑器 (Epi-dCas9) 设计持久表观遗传沉默的能力。我们阐明了有助于表观遗传重编程差异稳定性的顺式调控特征，例如活跃转录组蛋白标记 H3K36me3 和 H3K27ac 分别与对短期抑制的抵抗力和对长期沉默的抵抗力密切相关。H3K27ac 与 DNA 甲基化的增加呈负相关。有趣的是，仅当使用 KRAB-dCas9 和可靶向 DNA 甲基转移酶 (DNMT3A-dCas9 + DNMT3L) 组合时才观察到对 H3K27ac 的依赖，而当用可靶向 H3K27 组蛋白甲基转移酶 Ezh2 替换 KRAB 时则未观察到。此外，可编程 Ezh2 / DNMT3A + L 处理显示出增强的局部 DNA 甲基化工程，并且对不同的染色质状态不敏感。我们的结果强调了局部染色质特征对于可编程沉默的遗传性的重要性以及对基于 KRAB 和 Ezh2 的表观遗传编辑平台的差异响应。本研究获得的信息为理解上下文线索以更可预测地设计持久沉默提供了基本见解。
KRAB-dCas9 + DNMT3 和 Ezh2-dCas9 + 可遗传基因沉默的决定因素
精准表观基因组编辑作为一种在不改变遗传信息的情况下调节基因表达的方法，已引起广泛关注。然而，一个主要的限制因素是基因表达变化往往是暂时的，不像自然界中经常发生的终生表观遗传变化。在这里，我们系统地探究了基于 CRISPR / dCas9 的表观基因组编辑器 (Epi-dCas9) 设计持久表观遗传沉默的能力。我们阐明了有助于表观遗传重编程差异稳定性的顺式调控特征，例如活跃转录组蛋白标记 H3K36me3 和 H3K27ac 分别与对短期抑制的抵抗力和对长期沉默的抵抗力密切相关。H3K27ac 与 DNA 甲基化的增加呈负相关。有趣的是，仅当使用 KRAB-dCas9 和可靶向 DNA 甲基转移酶 (DNMT3A-dCas9 + DNMT3L) 组合时才观察到对 H3K27ac 的依赖，而当用可靶向 H3K27 组蛋白甲基转移酶 Ezh2 替换 KRAB 时则未观察到。此外，可编程 Ezh2 / DNMT3A + L 处理显示出增强的局部 DNA 甲基化工程，并且对不同的染色质状态不敏感。我们的结果强调了局部染色质特征对于可编程沉默的遗传性的重要性以及对基于 KRAB 和 Ezh2 的表观遗传编辑平台的差异响应。本研究获得的信息为理解上下文线索以更可预测地设计持久沉默提供了基本见解。
dCas9 与计算机设计的 PRC2 抑制剂融合，揭示远端启动子区域有功能性的 TATA 盒
Shiri Levy、1,2 Logeshwaran Somasundaram、1,2 Infencia Xavier Raj、1,2 Diego Ic-Mex、1,2 Ashish Phal、1,3 Sven Schmidt、1,2,17 Weng I. Ng、1,2 Daniel Mar、1,4 Justin Decarreau、2,5,6 Nicholas Moss、1,7,8 Ammar Alghadeer、1,9,10 Henrik Honkanen、1,2,18 Jay Sarthy、11,12 Nicholas Vitanza、13,14 R. David Hawkins、1,7,8 Julie Mathieu、1,15 Yuliang Wang、1,16 David Baker、2,5,6 Karol Bomsztyk、1,4 和 Hannele Ruohola-Baker 1,2,3,8,9,19, * 1 研究所华盛顿大学医学院干细胞与再生医学，美国华盛顿州西雅图 98109 2 华盛顿大学医学院生物化学系，美国华盛顿州西雅图 98195 3 华盛顿大学医学院生物工程系，美国华盛顿州西雅图 98105 4 华盛顿大学医学系、过敏和传染病科，美国华盛顿州西雅图 98195 5 华盛顿大学蛋白质设计研究所，美国华盛顿州西雅图 98195 6 华盛顿大学霍华德休斯医学研究所，美国华盛顿州西雅图 98195 7 华盛顿大学医学院医学系医学遗传学分部，美国华盛顿州西雅图 98195 8 华盛顿大学医学院基因组科学系，美国华盛顿州西雅图 98195 9 华盛顿大学牙科学院口腔健康科学系， WA 98109，美国 10 伊玛目阿卜杜勒拉赫曼·本·费萨尔大学牙科学院生物医学牙科科学系，沙特阿拉伯达曼 31441 11 弗雷德·哈钦森癌症研究中心基础科学部，华盛顿州西雅图 98109，美国 12 西雅图儿童医院癌症和血液病中心，华盛顿州西雅图 98105，美国 13 西雅图儿童研究所本·汤恩儿童癌症研究中心，华盛顿州西雅图，美国 14 华盛顿大学儿科系儿科血液学/肿瘤学分部，华盛顿州西雅图，美国 15 华盛顿大学比较医学系，华盛顿州西雅图 98195，美国 16 华盛顿大学保罗·G·艾伦计算机科学与工程学院，华盛顿州西雅图 98195，美国 17 现地址：尤利乌斯·马克西米利安斯·维尔茨堡大学，维尔茨堡 97070，德国 18 现地址：卡罗琳斯卡医学院学习、信息学、管理和伦理学系，斯德哥尔摩 17177，瑞典 19 主要联系人 *通信地址：hannele@u.washington.edu https://doi.org/10.1016/j.celrep.2022.110457
使用 dCas9 控制人类干细胞中的同源性定向修复结果
（未经同行评审认证）是作者/资助者。保留所有权利。未经许可不得重复使用。此预印本的版权所有者此版本于 2021 年 12 月 16 日发布。；https://doi.org/10.1101/2021.12.16.472942 doi：bioRxiv preprint
基于 CRISPR/dCas9 的系统：植物科学中的机制和应用
摘要：RNA 引导的基因组转录调控工具，即成簇的规律间隔短回文重复序列干扰 (CRISPRi) 和 CRISPR 介导的基因激活 (CRISPRa)，是基因功能研究的强大技术。这两个系统都源自 CRISPR/Cas9 系统，由催化失活的 Cas9 (dCas9)、转录效应物和单个引导 RNA (sgRNA) 组成。这种类型的 dCas9 无法切割 DNA，但保留了其特异性结合 DNA 的能力。dCas9/sgRNA 复合物与靶基因的结合导致转录干扰。CRISPR/dCas9 系统已被探索作为转录调控和基因组成像的工具。尽管 CRISPR/dCas9 系统具有潜在的应用和优势，但它也面临诸多挑战和限制，包括脱靶效应、原间隔区相邻基序 (PAM) 序列要求、高效的递送方法以及 CRISPR/dCas9 干扰作物在多个国家被标记为转基因生物。本综述重点介绍了 CRISPR/dCas9 技术的进展及其在作物改良中的应用和潜在挑战。
CRISPR/DCAS9工具包用于玉米基因的功能分析
确实有效。使用基于DCAS9（PDA2），DCAS9-VP64（PDA3）或DCAS9-SRDX（PDA4）载体的CRISPRA/CRISPRI原生质体系统，我们测试了前四个GRNA候选者的有效性，靶向PDS1，CHLH和TRXH和TRXH，FICE（FICE）和3和TRXH，FICE（FICE）和3（FICE）2及3次。与其他关于DCAS9活性的报道类似，我们观察到PDA2在CHLH表达上表现出一些抑制活性（图3A），尽管对于某些GRNA，PDA4的幅度较大（图3B）。用PDA3（CRISPRA构建体）测试，表明TRXH表达增加了两倍，具体取决于GRNA共转染了哪个GRNA（图3C）。这项研究中观察到的GRNA之间的有效性不同，重申了测试多个候选物的必要性。
循环，与条件无关的活性在一级运动皮层中预测矫正运动行为
不同细胞群体的位点特异性遗传和表观遗传靶向是分子神经科学的核心目标，对于理解基因调节机制至关重要，这些基因调节机制是基于复杂的表型和行为的基础。虽然最近的技术进步已经实现了对基因表达的前所未有的控制，但其中许多方法都集中在选定的模型生物上和/或需要针对不同应用的劳动密集型定制。群集定期插入短质体重复序列（基于CRISPR）的系统的简单性和模块化已改变了基因组编辑并扩展了基因调节工具箱。但是，几乎没有可用于神经元细胞选择性CRISPR调节的工具。我们设计，验证和优化的CRISPR激活（CRISPRA）和CRISPR干扰（CRISPRI）系统用于CRE重组酶依赖性基因调节。出乎意料的是，基于传统的双流传式开放阅读框（DIO）策略的CRISPRA系统即使没有CRE也会显示出漏水的靶基因诱导。因此，我们开发了一种含有内含子的CRE依赖性CRISPRA系统（SVI-DIO-DCAS9-VPR），该系统减轻了泄漏基因诱导，并在HEK293T细胞和大鼠原发性神经元培养物中的内源基因上的传统DIO系统表现优于传统的DIO系统。使用基因特异性CRISPR SGRNA，我们证明了SVI-DIO-DCAS9-VPR可以以CRE特异性方式激活许多大鼠或人类基因（GRM2，TENT5B，FOS，SSTR2和GADD45B）。为了说明该工具的多功能性，我们创建了一个平行的CRISPRI构建体，该构建体仅在CRE存在下仅在HEK293T细胞中成功抑制了荧光素酶报告器的表达。这些结果为跨不同模型系统的CRE依赖性CRISPR-DCAS9方法提供了强大的框架，并在与常见的CRE驱动线或通过病毒载体交付时实现了细胞特异性靶向。
依赖 Cre 的 CRISPR/dCas9 系统用于调控神经元的基因表达
对不同细胞群体进行位点特异性遗传和表观遗传靶向是分子神经科学的核心目标，对于理解复杂表型和行为背后的基因调控机制至关重要。虽然最近的技术进步使对基因表达的控制达到了前所未有的程度，但其中许多方法都集中在选定的模型生物上和/或需要针对不同应用进行劳动密集型定制。基于 CRISPR 的系统的简单性和模块化已经改变了基因组编辑的这一方面，提供了各种可能的应用和目标。然而，目前很少有可用于神经元中细胞选择性 CRISPR 调控的工具。在这里，我们设计、验证和优化了 CRISPR 激活 (CRISPRa) 和 CRISPR 干扰 (CRISPRi) 系统，以实现 Cre 重组酶依赖性基因调控。出乎意料的是，基于传统双链倒置开放阅读框 (DIO) 策略的 CRISPRa 系统在没有 Cre 的情况下表现出泄漏的靶基因诱导。因此，我们开发了一种内含子 Cre 依赖性 CRISPRa 系统 (SVI-DIO-dCas9-VPR)，该系统可缓解泄漏基因诱导，并且在 HEK293T 细胞和大鼠原代神经元培养物中，其在内源基因方面的表现均优于传统 DIO 系统。使用基因特异性 CRISPR sgRNA，我们证明 SVI-DIO-dCas9-VPR 可以以 Cre 特异性方式激活高度可诱导基因 (GRM2、Tent5b 和 Fos) 以及中等可诱导基因 (Sstr2 和 Gadd45b)。此外，为了说明此工具的多功能性，我们创建了一个平行的 CRISPRi 构建体，仅在存在 Cre 的情况下，它才成功抑制了 HEK293T 细胞中荧光素酶报告基因的表达。这些结果为不同模型系统中的 Cre 依赖性 CRISPR-dCas9 方法提供了一个强大的框架，并且当与常见的 Cre 驱动线或通过病毒载体进行 Cre 递送相结合时，将实现细胞特异性靶向。