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在没有错配修复的情况下，主要编辑的效率和保真度会得到增强
Prime 编辑 (PE) 是一种强大的基因组工程方法，能够将碱基替换、插入和删除引入任何给定的基因组位点。然而，PE 的效率差异很大，不仅取决于目标基因组区域，还取决于编辑细胞的遗传背景。在这里，为了确定哪些细胞因素会影响 PE 效率，我们针对 32 个 DNA 修复因子进行了有针对性的遗传筛选，涵盖了所有已报道的修复途径。我们表明，根据细胞系和编辑类型，错配修复 (MMR) 的消融可使 PE 效率提高 2-17 倍，涵盖多种人类细胞系、编辑类型和基因组位点。关键 MMR 因子 MLH1 和 MSH2 在 PE 位点的积累表明 MMR 直接参与 PE 控制。我们的研究结果为 PE 机制提供了新的见解，并提出了如何优化其效率。
通过 CRISPR 编辑鉴定出可提高胎儿血红蛋白表达的新型 HPFH 样突变
1 印度韦洛尔基督教医学院干细胞研究中心（班加罗尔 inStem 的一个单位）；2 印度特里凡得琅 Sree Chitra Tirunal 医学科学与技术研究所；3 美国伯克利加州大学伯克利分校创新基因组学研究所；4 美国旧金山格拉德斯通研究所数据科学与生物技术研究所；5 澳大利亚悉尼新南威尔士大学生物技术与生物分子科学学院；6 印度卡纳塔克邦马尼帕尔高等教育学院；7 印度韦洛尔基督教医学院暨医院血液学系；8 日本茨城县理化学研究所生物资源中心细胞工程部；9 日本红十字会中央血液研究所血液服务总部研究与开发部，日本东京；10 印度韦洛尔基督教医学院生物化学系； 11 加州大学洛杉矶分校微生物学、免疫学和分子遗传学系，美国洛杉矶；12 瑞士苏黎世生物系分子健康科学研究所
CRISPR/CAS9介导的洋葱中植物去饱和酶基因的编辑（Allium Cepa L.）
结果和讨论：在总共617个共培养Calli中，21（3.4％）再生芽表现出三种不同的表型：白化，嵌合和浅绿色；与野生型非转化的再生芽相比。在白化芽中，总叶绿素含量大大降低，并且在嵌合芽中显着降低。在六个CAS9基因确认的再生芽中，两种芽表现出由于插入/缺失（Indels）和ACPDS靶点位置和周围的基于替代的突变而引起的白化表型。深度扩增子测序显示两个SGRNA之间的indel频率显着，范围从1.2％到63.4％，以及53.4％的替代频率。ACPDS基因的突变产生了可检测到的白化病表型，因此确定了ACPDS基因的成功编辑。这是第一次在洋葱中成功建立了CRISPR/CAS9介导的基因组编辑方案，而ACPD基因作为一个例子。这项研究将为研究人员提供进一步的洋葱基础研究和应用研究的必要动力。
使用 CRISPR/Cas9 对无融合生殖四倍体草皮和牧草（Paspalum notatum Flügge ́）进行多等位基因编辑
多倍体在禾本科植物中很常见，对传统育种提出了挑战。基因组编辑技术绕过了杂交和自交，能够在一代中对多个基因拷贝进行有针对性的修改，同时保持许多多倍体基因组的杂合背景。巴哈草（Paspalum notatum Flügge ́；2 n =4 x =40）是一种无融合生殖的四倍体 C4 物种，在美国东南部广泛种植，作为肉牛生产和公用事业草坪的饲料。叶绿素生物合成基因镁螯合酶（MgCh）被选为在四倍体巴哈草中建立基因组编辑的快速读出目标。含有 sgRNA、Cas9 和 npt II 的载体通过基因枪法递送到愈伤组织培养物中。通过基于 PCR 的检测和 DNA 测序对编辑植物进行了表征，并观察到高达 99% 的 Illumina 读数的诱变频率。野生型 (WT) 巴哈草的测序显示，MgCh 的序列变异水平很高，这可能是因为存在至少两个拷贝，可能包含八种不同的等位基因，包括假基因。MgCh 突变体表现出明显的叶绿素消耗，叶片绿度降低了 82%。两种品系显示出随时间推移的编辑进展，这与体细胞编辑有关。获得了嵌合 MgCh 编辑事件的无融合生殖后代，并允许在一系列叶绿素消耗表型中识别出统一编辑的后代植物。高度编辑的突变体的 Sanger 测序显示 WT 等位基因的频率升高，可能是由于频繁的同源定向修复 (HDR)。据我们所知，这些实验是首次报道将基因组编辑应用于多年生暖季草皮或牧草。该技术将加速巴哈草品种的开发。
微粒介导的 CRISPR DNA 递送用于杨树基因组编辑
目前，CRISPR/Cas9 的使用是植物（包括生物量作物杨树）精确基因组工程的首选方法。在杨树中传递 CRISPR/Cas9 及其成分的最常用方法是通过农杆菌介导的转化，除了所需的基因编辑事件外，还会导致稳定的 T-DNA 整合。在这里，我们探索了通过 DNA 包被的微粒轰击将基因编辑试剂传递到模型树 Populus tremula x P. alba 中，以评估其开发无转基因、基因编辑树的潜力，以及其在特定靶位整合供体 DNA 的潜力。使用优化的转化方法，有利于再生暂时表达所传递供体 DNA 上基因的植物，我们再生了不含 Cas9 和抗生素抗性编码转基因的基因编辑植物。此外，我们报告了供体 DNA 片段在 Cas9 诱导的双链断裂处频繁整合，为靶向基因插入提供了机会。
通过 Cas12a/CBE 共编辑在 T0 代中产生无转基因抗溃疡病 Citrus sinensis cv. Hamlin
柑橘溃疡病影响柑橘生产。该病由柑橘黄单胞菌（Xcc）引起。先前的研究证实，在 Xcc 感染期间，转录激活因子样效应物 (TALE) PthA4 会从病原体转移到宿主植物细胞中。PthA4 与溃疡病易感基因 LOB1（EBE PthA4 -LOBP）启动子区中的效应物结合元件 (EBE) 结合，激活其表达，随后引起溃疡症状。之前，采用 Cas12a/CBE 共编辑方法破坏高度纯合的柚子的 EBE PthA4 -LOBP。然而，大多数商业柑橘品种都是杂合杂交种，更难产生纯合/双等位基因突变体。在这里，我们采用 Cas12a/CBE 共编辑方法来编辑 Hamlin（Citrus sinensis）的 EBE PthA4 -LOBP，这是一种在世界范围内种植的商业杂合柑橘品种。构建了二元载体 GFP- p1380N-ttLbCas12a:LOBP1-mPBE:ALS2:ALS1，并证明其可通过 Xcc 促进的农杆菌素过滤在 Hamlin 叶片中发挥作用。该构建体允许通过 GFP 选择无转基因再生体，编辑 ALS 以生成抗氯磺隆再生体作为基因组编辑的选择标记，这是通过 nCas9-mPBE:ALS2:ALS1 瞬时表达 T-DNA 的结果，并通过 ttLbCas12a 编辑感兴趣的基因（即本研究中的 EBE PthA4 -LOBP），从而产生无转基因柑橘。共产生了 77 株幼苗。其中 8 株幼苗为转基因植株（#Ham GFP 1 - #Ham GFP 8），4 株幼苗为非转基因植株（#Ham NoGFP 1 - #Ham NoGFP 4），其余为野生型。在 4 株非转基因幼苗中，三个品系（#Ham NoGFP 1、#Ham NoGFP 2 和 #Ham NoGFP 3）含有 EBE pthA4 的双等位基因突变，一个品系（#Ham NoGFP 4）含有 EBE pthA4 的纯合突变。我们在 C. sinensis cv. Hamlin 中实现了 EBE PthA4 – LOBP 的 5.2% 非转基因纯合/双等位基因突变效率，而之前研究中柚子的突变效率为 1.9%。重要的是，存活下来的 4 株无转基因植株和 3 株转基因植株均能抵抗柑橘
工程的PEGRNA提高了Prime编辑效率
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体内腺嘌呤碱基编辑恢复了C282Y并改善了血色素沉重小鼠的铁代谢
血色素沉着症是白人种群中最常见的遗传代谢疾病之一，主要起源于HFE基因中的纯合C282Y突变。g>在基因的845位置的转变会导致HFE蛋白的折叠折叠，最终导致其在细胞膜上不存在。因此，与转素受体1和2缺乏相互作用导致系统性铁超载。我们在高度精确的细胞培养分析中筛选了潜在的GRNA，并应用了表达腺嘌呤基础编辑器ABE7.10的AAV8拆分矢量，并在129- HFE TM.1.1.1NCA小鼠中筛选了我们的候选GRNA。在这里，我们表明我们的治疗载体单次注射导致基因校正率> 10％，并且肝脏中铁代谢的改善。我们的研究提出了针对影响人类最常见的遗传疾病之一的靶向基因矫正疗法的概念验证。
改进的 gRNA 二级结构允许编辑抵抗 CRISPR-Cas9 切割的靶位
CRISPR-Cas9 介导的基因组编辑的第一步是切割与 CRISPR 向导 RNA (gRNA) 中所谓的间隔序列互补的目标 DNA 序列。然而，一些 DNA 序列对 CRISPR-Cas9 切割具有抵抗性，这至少部分是由于 gRNA 折叠错误造成的。为了解决这个问题，我们设计了 gRNA，使其恒定部分具有高度稳定的发夹结构，并通过化学修饰进一步增强了它们的稳定性。“基因组编辑优化锁定设计”(GOLD)-gRNA 将基因组编辑效率提高了约 1000 倍（从 0.08% 到 80.5%），其他不同靶标的平均效率提高了 7.4 倍。我们预计，无论间隔序列组成如何，这种改进的 gRNA 都将实现高效编辑，并且在所需的基因组位点难以编辑时将特别有用。