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对人类细胞模型的观点：基于CRISPR-CAS与患者衍生的IPSC模型的优势和缺点
摘要：神经遗传疾病代表具有遗传原因和临床表现差的广泛疾病。在其中，聚合酶 - γ（POLG） - 谱系疾病相对较常见，估计的疾病频率约为1：10.000。同样，POLG基因中的突变是迄今为止线粒体病的最重要原因。polg-spectrum疾病通常会导致脑功能的逐渐丧失，并且可能涉及严重和致命的脑病，癫痫发作和神经肌肉疾病，以及在某些情况下的心脏和肝衰竭。疾病的发作可能从成年到成年后期，疾病持续时间从严重病例到几十年的数周不等。 没有治疗方法；当前的动物模型不会忠实地概括Human疾病，从而使临床前治疗研究变得复杂。 必须采取基于人类的临床前模型系统来理解人类疾病机制并开发治疗方法。 在这篇综述中，我们概述了当前在人类细胞和神经元中进行神经遗传疾病的方法，重点是Polg-Spectrum疾病。 我们讨论了使用神经元细胞以及当前可用的细胞模型的影响和陷阱，即基于（i）CRISPR（i）（i。e。，遗传上有能力）并引起多能干细胞（IPSC）（I。e。e。，类似）的神经元模型（i。衍生的神经元。疾病的发作可能从成年到成年后期，疾病持续时间从严重病例到几十年的数周不等。没有治疗方法；当前的动物模型不会忠实地概括Human疾病，从而使临床前治疗研究变得复杂。必须采取基于人类的临床前模型系统来理解人类疾病机制并开发治疗方法。在这篇综述中，我们概述了当前在人类细胞和神经元中进行神经遗传疾病的方法，重点是Polg-Spectrum疾病。我们讨论了使用神经元细胞以及当前可用的细胞模型的影响和陷阱，即基于（i）CRISPR（i）（i。e。，遗传上有能力）并引起多能干细胞（IPSC）（I。e。e。，类似）的神经元模型（i。衍生的神经元。尽管根据定义，细胞模型无法概括人类疾病的各个方面，但它们仍然是发现疾病机制并开发治疗神经发生疾病的方法的合理点。
iPSC 衍生的类器官作为再生医学和肿瘤学的治疗模型
过去十年干细胞生物学的进步为将这些进步转化为临床应用和塑造再生医学的未来提供了前所未有的潜力。类器官技术是这些主要发展之一，它来源于原代组织或最近的诱导性多能干细胞 (iPSC)。iPSC 技术的使用提供了癌症建模的可能性，特别是在具有生殖系致癌突变的遗传性癌症中。同样，它的优势在于可以使用 CRISPR 介导的基因编辑引入特定的致癌改变来进行基因组编辑。在再生医学领域，iPSC 衍生的类器官有望用于生成用于器官修复的未来先进治疗药物 (ATMP)。最后，它们似乎可以成为非常有用的实验工具，用于确定 SARS-Cov-2 感染的细胞靶点，从而测试抗 Covid 药物。因此，随着基因组编辑的可能性和向功能组织分化的新协议的开发，预计 iPSC 衍生的类器官技术也将成为医学所有领域的治疗工具。
SCNA基因的三重一式固定和同基因IPSC衍生的神经元培养物，用于建模α-
我们通过重编程帕金森氏病患者的SCNA基因三重三次固定（3XSNCA）的帕金森氏病患者的外周血单核细胞产生了IPSC。患者患有少年发作的严重形式的帕金森氏病。CRISPR/CAS9基因编辑来使超核SCNA基因拷贝失活，以使患者的等生IPSC系作为固有的控制细胞。3xSNCA IPSC分化为皮质或多巴胺能神经元培养物，并最终暴露于预先形成的αSyn蛋白组件中，以加速内源性αSyn聚集体的产生。非常明显的是，患者衍生的神经元开发了类似于患者脑组织中通常描述的Lewy身体的FrankαSynperisasic骨聚集体。患者衍生的神经元显示出有限的生存率，代谢功能障碍和明显的基因表达改变，如RNA-SEQ转录组分析所概述。
简化的CRISPR工作流程引入突变并产生用于建模肌萎缩性横向硬化症ERIC DENEAULT 1，MATHILD
1 1，麦吉尔大学，麦吉尔大学，麦克吉尔大学，蒙特利尔，QC加拿大QC H3A 2B4 *通讯作者：thomas.durcan@mcgill.ca摘要肌营养性侧面硬化症（ALS）代表着一种复杂的神经变性疾病，具有重要的属性症状。 迄今为止，遗传病因和驱动该疾病的潜在分子机制均尚未了解，尽管近年来，许多研究突出了许多ALS的遗传突变。 这些突变指出了可能在ALS中可能影响的潜在途径，具有产生人类神经元的能力和包含这些突变的其他疾病相关细胞的能力，如果出现新疗法，则变得更加关键。 随着诱导多能干细胞（IPSC）的出现，并定期间隔短的短文重复序列（CRISPR）基因编辑场为我们提供了在IPSC基因组中引入或纠正特定位点的特定突变的工具，从而模拟了风险突变的特定贡献。 在这项研究中，我们描述了一种将突变引入控制线或纠正突变的快速有效方法，从具有给定突变的患者衍生的IPSC产生了ISEGENIC控制线。 引入的突变是将G93A突变分成SOD1或H517Q中的FUS，而校正的突变是SOD1中I114T的患者IPSC线。 通过IPSCS和CRISPR编辑的组合，此处生成的细胞将提供对ALS中神经元变性的分子机制的基本见解。1，麦吉尔大学，麦吉尔大学，麦克吉尔大学，蒙特利尔，QC加拿大QC H3A 2B4 *通讯作者：thomas.durcan@mcgill.ca摘要肌营养性侧面硬化症（ALS）代表着一种复杂的神经变性疾病，具有重要的属性症状。迄今为止，遗传病因和驱动该疾病的潜在分子机制均尚未了解，尽管近年来，许多研究突出了许多ALS的遗传突变。这些突变指出了可能在ALS中可能影响的潜在途径，具有产生人类神经元的能力和包含这些突变的其他疾病相关细胞的能力，如果出现新疗法，则变得更加关键。随着诱导多能干细胞（IPSC）的出现，并定期间隔短的短文重复序列（CRISPR）基因编辑场为我们提供了在IPSC基因组中引入或纠正特定位点的特定突变的工具，从而模拟了风险突变的特定贡献。在这项研究中，我们描述了一种将突变引入控制线或纠正突变的快速有效方法，从具有给定突变的患者衍生的IPSC产生了ISEGENIC控制线。引入的突变是将G93A突变分成SOD1或H517Q中的FUS，而校正的突变是SOD1中I114T的患者IPSC线。通过IPSCS和CRISPR编辑的组合，此处生成的细胞将提供对ALS中神经元变性的分子机制的基本见解。小分子和生长因子的组合被用来指导编辑的细胞逐步分化为运动神经元，以证明可以为下游应用生成相关的疾病细胞。关键字：CRISPR，ISEGONIC IPSC，ALS，SOD1 -I114T，SOD1 -G93A，FUS -H517Q
利用基因组编辑的恒河猴 iPSC 生成具有改变的病毒敏感性的巨噬细胞来模拟人类疾病
由于与人类生物学相似性高，非人类灵长类动物 (NHP) 模型对于开发基于诱导性多能干细胞 (iPSC) 的细胞和再生器官移植疗法非常有用。然而，关于 NHP-iPSC（尤其是恒河猴 iPSC）的建立、分化和遗传改造的知识有限。我们通过结合 Yamanaka 重编程因子和两种抑制剂（GSK-3 抑制剂 [CHIR 99021] 和 MEK1/2 抑制剂 [PD0325901]），成功地从恒河猴外周血 (Rh-iPSC) 中建立了 iPSC，并通过造血祖细胞将这些细胞分化为功能性巨噬细胞。为了证实 Rh-iPSC 衍生的巨噬细胞作为疾病模型生物测定平台的可行性，我们通过 CRISPR-Cas9 敲除了 Rh-iPSC 中的 TRIM5 基因，这是一种物种特异性 HIV 抗性因子。TRIM5 敲除 (KO) iPSC 具有与 Rh-iPSC 相同的巨噬细胞分化潜能，但分化后的巨噬细胞在体外对 HIV 感染的敏感性有所增加。我们用于获得 Rh-iPSC 衍生的巨噬细胞的重编程、基因编辑和分化方案可应用于其他基因突变，从而扩大 NHP 基因治疗模型的数量。
利用基因组编辑的恒河猴 iPSC 生成具有改变的病毒敏感性的巨噬细胞来模拟人类疾病
由于与人类生物学相似性高，非人类灵长类动物 (NHP) 模型对于开发基于诱导性多能干细胞 (iPSC) 的细胞和再生器官移植疗法非常有用。然而，关于 NHP-iPSC（尤其是恒河猴 iPSC）的建立、分化和遗传改造的知识有限。我们通过结合 Yamanaka 重编程因子和两种抑制剂（GSK-3 抑制剂 [CHIR 99021] 和 MEK1/2 抑制剂 [PD0325901]），成功地从恒河猴外周血 (Rh-iPSC) 中建立了 iPSC，并通过造血祖细胞将这些细胞分化为功能性巨噬细胞。为了证实 Rh-iPSC 衍生的巨噬细胞作为疾病模型生物测定平台的可行性，我们通过 CRISPR-Cas9 敲除了 Rh-iPSC 中的 TRIM5 基因，这是一种物种特异性 HIV 抗性因子。TRIM5 敲除 (KO) iPSC 具有与 Rh-iPSC 相同的巨噬细胞分化潜能，但分化后的巨噬细胞在体外对 HIV 感染的敏感性有所增加。我们用于获得 Rh-iPSC 衍生的巨噬细胞的重编程、基因编辑和分化方案可应用于其他基因突变，从而扩大 NHP 基因治疗模型的数量。
使用HIPSC解释了对蒽环类药物诱导的心脏毒性
蒽环类家族的抗癌药通常与引起心脏毒性的潜力有关。解决了为什么特定患者倾向于蒽环类诱导的心脏毒性（AIC）的问题，研究人员进行了大量的药物基因组学研究，并记录了与AIC相关的60多个基因座。迄今为止，这些已确定的基因座都没有被发展为FDA批准的生物标志物，用于常规临床实践。随着人类诱导的多能干细胞衍生的心肌细胞，测序技术和基因组编辑技术的进步，与AIC相关的变体现在可以在人类模型中得到验证。在这里，我们从与AIC相关的已知遗传变异方面进行了全面概述，从人体诱导的多能干细胞衍生的心肌细胞如何使用来帮助更好地解释对AIC的基因组偏爱。
用于疾病研究的 EBiSC iPSC 库
欧洲诱导多能干细胞库 (EBiSC) 是一个非营利性机构，用于储存、银行、质量控制 (QC) 和随后分发研究级人类诱导多能干细胞 (iPSC) 系，该机构集中了国际上在 35 多个疾病领域生成的 iPSC 系，并通过 EBiSC 目录将其提供给用户，供研究使用 (cells.ebisc.org/)。在购买之前，可以访问全面的数据集，其中详细说明了原始组织样本的疾病背景、iPSC 重编程的背景和细胞系特征数据。EBiSC 还执行严格的 QC 筛选，以确保提供可靠、特征明确的 iPSC 系，符合 ISO9001:2015 原则。特定 iPSC 系的全基因组测序数据可从欧洲基因组档案库下载，但须向 EBiSC 数据访问委员会提出申请。 EBiSC 访问和使用协议需要在发货前填写，可从网站下载，同时下载特定的细胞系信息包；这些文件共同阐明了如何使用 EBiSC 细胞系进行研究，并详细说明了可能适用的任何特定第三方义务和/或使用限制。还提供了有关如何培养和监测 iPSC 细胞系（包括实施常规细胞系筛选）的协议。第二个项目阶段将继续收集国际上生成的 iPSC 细胞系，使用改进的自动化策略提供 iPSC 衍生的差异化产品以进行升级，并开发 EBiSC 提供的现有服务，包括 iPSC 重编程、基因编辑和特性描述。
RBM20缺陷DCM的IPSC建模将RBM20的上调视为一种治疗策略 治疗引起的衰老：改善抗癌治疗的机会 心血管磁共振中的深度学习模型的多级比较：关于建筑变化的冗余 线粒体DNA中氧化链的命运 Granie和Granpa：推理和评估增强子介导的基因调节网络 胆管癌中循环肿瘤DNA的基因分型揭示 通过SARS-COV-2感染反应的合成遗传追踪发现的上皮免疫的药理调节剂 相似的神经通路联系了心理压力和大脑... 阿霉素会改变活性启动子周围基因组的空间组织 剖析成年神经干细胞的时空多样性 突触囊泡的分子结构-MDC存储库
Francesca Briganti，1,2,3,4,15 Han Sun，3,15 Wu Wei，5 Jingyan Wu，3 Chenchen Zhu，3 Martin Liss，6 Martin Liss，6 Ioannis Karakikes，7 Shannon Rego，3 Shannon Rego，3 Andrea Cipriano，8 Andrea Cipriano，8 Michael Snyder，3 Benjamin Meder，5 Genjamin Meder，5 gules Meder，5,9 xu xu xu xu xu xu，xu n. xu n. xu xu，x.9。 Gotthardt，6,12,13 Mark Mercola，4 *和Lars M. Steinmetz 1,3,4,5,14,16， * 1欧洲分子生物学实验室（EMBL），基因组生物学单位，海德堡，德国海德堡2美国加利福尼亚州斯坦福大学的斯坦福大学4心血管研究所和医学系，斯坦福大学，美国加利福尼亚州斯坦福大学，美国5斯坦福大学基因组技术中心，斯坦福大学，斯坦福大学，加利福尼亚州帕洛阿尔托，美国6 Neuromuscular and Cardiovascular and Cardiovascular Cell Bimogology，Max delbr€uck ucker for Cardior for Cardiquar for Cardiquar and Cardior for Cardior of Cardiquar and Cardior of Cardiquar and Cardior of Cardior of Cardior of Cardior of Cardiorcult Stanford University, Stanford, CA, USA 8 Department of Obstetrics and Gynecology, Stanford University, Stanford, CA, USA 9 Institute for Cardiomyopathies Heidelberg and Department of Internal Medicine III, University of Heidelberg, Heidelberg, Germany 10 SOPHiA Genetics, St. Sulpice, Switzerland 11 Laboratoire de Cardioge´ ne´ tique Mole´ culaire, Centre de Biologie Et Pathologie EST，Lostices Civil De Lyon，Lyon，法国12个心脏病学系，Charite´ -Universita tsmedizin柏林，柏林，德国，柏林，柏林，13 DZHK：德国心血管研究中心，柏林，柏林，德国柏林，德国，14 DZHK，DZHK：德国副作用，副作用Embl Hebberg，Heidelberg，Heidelberg，Heidelberg，Heidelberg，Heidelberg，Heidelberg，Heidelberg联系 *信件：mmercola@stanford.edu（M.M.），larsms@stanford.edu（l.m.s.）
人类 iPSC 亚型定向分化为心房和心室心肌细胞
15. 将 Matrigel 包被的培养板和 hiPSC 培养基预热至 20-25 C。16. 从预包被的培养板中吸出 Matrigel 并加入 hiPSC 培养基（6 孔板每孔 2 ml）。17. 将 9 ml hiPSC 培养基加入到 15 ml 离心管中。18. 将低温小瓶直接转移到 37 C 水浴中并观察解冻过程。当管中大部分内容物解冻并仅剩下一小块冰时，迅速取出并用 70％ 乙醇彻底清洗。19. 小心地将细胞逐滴转移到准备好的带有培养基的 15 ml 离心管中。以 200 3 g 的速度离心 5 分钟。20. 小心吸出上清液。将沉淀物悬浮在 hiPSC 培养基（例如 1 ml）中，并接种到准备好的 Matrigel 包被的培养板上。前 24 小时加入 1 ml/ml 2 mM Thiazovivin（最终浓度 2 m M）。21. 如果 24 小时后细胞附着良好，则用 hiPSC 培养基更换培养基。如果附着力较低，再加入 1 ml/ml 2 mM Thiazovivin（最终浓度 2 m M），培养 24 小时。从第二天开始，每天更换培养基，每孔（6 孔）加入 2 ml hiPSC 培养基。继续“hiPSC 传代和维护”，步骤 1-8。