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用于溶媒梭菌基因组和转录组工程的合成生物学工具
梭菌属菌株用于生产各种增值产品，包括燃料和化学品。任何商业上可行的生产工艺的开发都需要菌株和发酵工艺开发策略的结合。梭菌属的菌株开发可以通过随机诱变和靶向基因改造方法实现。然而，由于缺乏有效的基因组和转录组工程工具，通过靶向基因改造方法对梭菌属的菌株进行改良具有挑战性。最近，已经开发出各种合成生物学工具来促进产溶剂梭菌的菌株工程。在这篇综述中，我们整合了产溶剂梭菌基因组和转录组工程工具箱开发的最新进展。在这里，我们回顾了采用移动 II 组内含子、pyrE 等位基因交换和 CRISPR/Cas9 的基因组工程工具及其在梭菌属菌株开发中的应用。接下来，在梭菌菌株工程的背景下，还讨论了转录组工程工具，例如非翻译区 (UTR) 工程和合成 sRNA 技术。应用任何这些讨论的技术都将促进梭菌的代谢工程，以开发具有所需功能属性的改良菌株。这可能导致开发出一种经济可行的丁醇生产工艺，提高滴度、产量和生产率。
进化保守的共核基因对于1
（a）CLE受体8同源物的数量。（b）子类-II LRR-RLK的系统发育9，基于贝叶斯方法11生成10，基于保守的激酶12结构域。在14个节点显示树的后部13个概率。Coleochaete序列15用作外组。土地16植物序列形成一个17个单系进化枝，可以将18分为三个亚组，如右侧所示。插图显示20种具有21个系统发育关系的物种列表。（c）22个基因/蛋白质结构和23个基因组编辑等位基因MPCCIK。24（顶部）MPCIK的蛋白质结构。 25（中间）26 MPCIK/MP7G14210基因座的结构，具有27个设计指南28 RNA（GRNA）的位置。 （底部）基因组编辑等位基因的基因分型。 目标指南序列为29，BOLD序列为蓝色。 已删除的碱在洋红色中用连字符指示。 30外显子和内含子分别用资本和小字母表示。 从基因组DNA序列推导的WT和突变蛋白的 N末端区域32在下面指示32。 星号表示翻译终止。 （d）10天的总体形态 - 从吉玛（Gemmae）生长的33种旧植物。 比例尺代表0.5毫米。 3424（顶部）MPCIK的蛋白质结构。25（中间）26 MPCIK/MP7G14210基因座的结构，具有27个设计指南28 RNA（GRNA）的位置。（底部）基因组编辑等位基因的基因分型。目标指南序列为29，BOLD序列为蓝色。已删除的碱在洋红色中用连字符指示。30外显子和内含子分别用资本和小字母表示。从基因组DNA序列推导的WT和突变蛋白的 N末端区域32在下面指示32。 星号表示翻译终止。 （d）10天的总体形态 - 从吉玛（Gemmae）生长的33种旧植物。 比例尺代表0.5毫米。 34N末端区域32在下面指示32。星号表示翻译终止。（d）10天的总体形态 - 从吉玛（Gemmae）生长的33种旧植物。比例尺代表0.5毫米。34
SALSA® 参考选择和分类 DNA SD084-S02
131 参考 00797-L25925 A1 2 136 参考 18457-L23634 A1 2 143 SMN1 / 内含子 7 S0938-L26163 A1 nag27134T>G 148 SMN1 / 外显子 8 S0961-L25586 A1 nag27706-27707delAT 154 SMN1 / 外显子 8 S0960-L25957 A1 2 163 参考 02291-L17086 A1 2 172 参考 02978-L17087 A1 2 183 SMN1 / 外显子 7 14919-L17081 A1 2 191 参考 00559-L17088 A1 2 200 参考 00976-L17298 A1 2 208 参考 12490-L17096 A1 2 228 参考 14498-L17101 A1 2 237 参考 02334-L17301 A1 2 245 参考 14293-L17100 A1 2 255 参考 13128-L17099 A1 2 264 参考 07630-L17091 A1 2 272 参考 14361-L17098 A1 2 282 SMN2 / 外显子 7 14921-L17083 A1 2 292 参考 18491-L23716 A1 2 301 参考 12783-L13918 A1 2 311 参考 06425-L17092 A1 2 321 参考 01042-L17093 A1 2 331 参考 01043-L17094 A1 2 注意：此处使用的突变命名法可能与文献不同！此 SD084-S02 参考选择和分箱 DNA 产品说明中使用的外显子编号是传统的外显子编号（外显子 1、2a、2b 和 3-8）。此外显子编号与 SMN1 和 SMN2 的 NCBI 参考序列不同。有关所用外显子编号和基因转录本的更多信息，请查阅相应的探针混合物产品说明。
利用 CRISPR-Cas9 基因编辑弗里德赖希共济失调患者的造血干细胞
弗里德赖希共济失调 (FRDA) 是一种常染色体隐性神经退行性疾病，由 frataxin (FXN) 基因内含子 1 中的 GAA 重复扩增引起，导致线粒体铁结合蛋白 frataxin 的表达显著降低。我们之前报告说，同基因造血干细胞和祖细胞 (HSPC) 移植可防止 FRDA 小鼠模型 YG8R 中的神经退行性。我们表明，挽救机制是由功能性 frataxin 从 HSPC 衍生的小胶质细胞/巨噬细胞转移到神经元/肌细胞所介导的。在本研究中，我们报告了使用 CRISPR-Cas9 系统进行 FRDA 自体 HSPC 移植的第一步。我们首次鉴定出一对 CRISPR RNA（crRNA），它们可有效消除人类 FRDA 淋巴母细胞中的 GAA 扩增，恢复 frataxin 表达的非病理水平，并使线粒体活动正常化。我们还优化了从健康和 FRDA 患者外周血中分离的 HSPC 中的基因编辑方法，并证明基因编辑细胞在体外和体内造血正常。该过程不会诱发细胞毒性作用或重大脱靶事件，但在基因编辑细胞中观察到 p53 介导的细胞增殖延迟。这项研究为将基因校正的 HSPC 自体移植用于 FRDA 的临床转化奠定了基础。
生理学。 res。 69：967-994，2020 https：//doi.org/10.33549/physiolres.934529审查线粒体DI
简介线粒体是正常生理与健康的古老细胞器（Henze and Martin 2003）。他们负责细胞代谢的各个方面。氧化磷酸化系统（OXPHOS）位于线粒体内部膜上，产生了约90％的细胞能量货币，三磷酸腺苷（ATP）（Rich 2003）。此外，线粒体参与了许多其他功能 - 这些包括三羧酸周期（即krebs循环），尿素循环，糖异生和生酮发生，钙信号的酶，自适应热发生，离子稳态，脂肪酸氧化，氨基酸代谢，脂质代谢以及反应氧的生理产生（ROS）。线粒体还可以从类固醇，出血和铁 - 硫簇的生物合成中构成单个步骤，并在程序性细胞死亡中发挥作用（Voet等人2013）。此外，线粒体结构和功能在两个基因组的控制下，核和线粒体。与核基因组不同，线粒体DNA（mtDNA）是母遗传的，并且每个细胞中最多有几千份，具体取决于细胞类型（Sciaccco等人。1994，Taylor和Turnbull 2005）。 大多数序列是编码，缺乏内含子 - 外观结构，大多数基因都位于DNA分子的一条上。 1 500个线粒体蛋白中的绝大多数由核基因编码。 线粒体DNA仅针对13个结构1994，Taylor和Turnbull 2005）。大多数序列是编码，缺乏内含子 - 外观结构，大多数基因都位于DNA分子的一条上。1 500个线粒体蛋白中的绝大多数由核基因编码。线粒体DNA仅针对13个结构
基于XX、XY和YY基因组测序鉴定南方鲶鱼（Silurus meridionalis）的性染色体和性别决定基因
硬骨鱼类是研究性染色体和性别决定 (SD) 基因的重要模型，因为它们呈现出多种性别决定系统。在这里，我们使用 Nanopore 和 Hi-C 技术对 YY 南方鲶鱼 (Silurus meridionalis) 进行高连续性染色体水平基因组组装。组装长 750.0 Mb，其中重叠群 N50 为 15.96 Mb，支架 N50 为 27.22 Mb。我们还测序并组装了一个 XY 雄性基因组，其大小为 727.2 Mb，重叠群 N50 为 13.69 Mb。通过与我们之前组装的 XX 个体进行比较，我们确定了一个候选 SD 基因。通过对雄性和雌性池进行重新测序，我们在 Chr24 上鉴定了一个 2.38 Mb 的性别决定区 (SDR)。读取覆盖度分析和 X 和 Y 染色体序列比较表明，SDR 中有一个 Y 特异性插入（约 500 kb），其中包含 amhr2 的雄性特异性重复（名为 amhr2y）。amhr2y 和 amhr2 在编码区具有相同的核苷酸同一性（81.0%），但在启动子和内含子区域具有相同的核苷酸同一性，但较低。在雄性性腺原基中的独家表达和诱导雄性到雌性性别逆转的功能丧失证实了 amhr2y 在雄性性别决定中的作用。我们的研究为鱼类中 amhr2 作为 SD 基因提供了一个新的实例，并揭示了不同鱼类谱系中性别决定进化背后的 AMH/AMHR2 通路成员重复的趋同进化。
产生两个杂合的 GATA2 CRISPR/Cas9-...
GATA2 缺陷属于世界卫生组织 (WHO) 新近确定的一组易患髓系恶性肿瘤的遗传综合征（Smith et al., 2004）。具有种系杂合 GATA2 突变的个体表现出非常复杂和多系统的表现型，包括血细胞减少导致的 MDS、免疫缺陷（涉及 B、NK、单核细胞、CD4 +、DC 细胞谱系）、耳聋和淋巴水肿（Hahn et al., 2011）。根据文献报道，至少 75% 的 GATA2 突变携带者在估计的中位年龄 20 岁时患上 MDS/AML（Wlodarski et al., 2016）。如今，化疗和同种异体造血干细胞 (HSC) 移植仍然是唯一具有良好反应的治疗方法。由于缺乏可靠的疾病模型系统，我们无法从机制上理解 GATA2 单倍体不足如何影响造血发育。种系 GATA2 突变要么是截短的功能丧失 (LOF) 突变，要么是 ZF2 的错义突变，要么是破坏内含子 4 增强子位点的突变 ( Wlodarski et al., 2016 )。这些突变被认为会导致 GATA2 功能降低/丧失，特别是消除 ZF2 的 DNA 结合功能 ( Chong et al., 2018 )。迄今为止，只有少数种系 GATA2 突变进行了功能研究。因此，使用精确的基因编辑策略，我们生成了携带两种最
ZBED6‐IGF2 轴对小鼠成肌细胞代谢调节的重要性
摘要转录因子 ZBED6 充当 Igf2 的抑制因子，并直接或间接影响数千个基因的转录调控。在这里，我们在小鼠 C2C12 成肌细胞中使用基因编辑，并表明 ZBED6 仅通过其在 Igf2 内含子 1 中的结合位点 5′-GGCTCG-3′ 来调节 Igf2。删除这个基序（Igf2 ΔGGCT）或完全消融 Zbed6 会导致 IGF2 蛋白上调约 20 倍。定量蛋白质组学显示，在 Zbed6 −/− 和 Igf2 ΔGGCT 成肌细胞中 Ras 信号通路均被激活，并且在 Zbed6 −/− 成肌细胞中表现出表达改变的蛋白质中线粒体膜蛋白显著富集。Zbed6 −/− 和 Igf2 ΔGGCT 成肌细胞均表现出更快的生长速度并发展为肌管肥大。由于 IGF2 上调，这些细胞表现出 O 2 消耗率增加。转录组分析显示，Zbed6 −/− 和 Igf2 ΔGGCT 肌管中差异表达基因的重叠度约为 30%，其中上调的基因与肌肉发育有关。相反，成肌细胞中的 ZBED6 过表达导致细胞凋亡、细胞周期停滞、线粒体活动减少以及成肌细胞分化停止。在 Zbed6 −/− 和 Igf2 ΔGGCT 成肌细胞中观察到的生长和分化表型的相似性表明 ZBED6 主要通过调节 IGF2 表达来影响线粒体活动和肌肉生成。这项研究为 ZBED6-Igf2 轴如何影响肌肉代谢提供了新的见解。
情节扭曲：当RNA证据挑战我们对DNA结果的期望时，Alexandra Richardson，MS； Terra Brannan，博士； Colin Young博士； Marcy Richa
情节扭曲：当RNA证据挑战我们对DNA结果的期望时，Alexandra Richardson，MS； Terra Brannan，博士； Colin Young博士； Marcy Richardson博士； Carrie Horton，MS-CGC； Heather Zimmermann，博士背景：配对的DNA和RNA测试（DGT-RGT）通过检测位于标准的下一代序列（NGS）捕获以外的剪接变体和提供变体分类中的证据范围来提高DNA结果的准确性。DGT-RGT的另一个好处是识别导致意外或非常规剪接事件的变体。在这里，我们提出了一个变异级别的病例系列，该病例序列突出了通过DGT-RGT在一个临床诊断实验室中鉴定出的意外RNA发现。变体呈现：变体1-NF1 C.888+2T> C会影响剪接供体部位内的规范位置，从而根据当前ACMG指南将其分类为病原（LP）。最近的研究表明，+2位置的T> c取代能够在某些基因组环境中产生野生型转录本。DGT-RGT并未确定与该变体相关的明显异常剪接，这与载体中缺乏神经纤维瘤病一致。变体2- BRIP1 c.727a> g（p.i243v）是中期错义变化，在硅剪接站点中，该算法预测了创建强大的de从头供体站点。RNA研究证实了这种新型供体部位的使用，但出乎意料地表明，外显子内的现有隐性受体位点同时被激活，从而有效地在外显子内产生了伪内龙。在计算机剪接算法中预测了新型U2受体位点的创建。变体3＆4 NF1 C.5750-184_5750-178 duptttcttc和atm c.3480g> t（p.v1160v）分别是内含子和同义中的中性和同义性中性变化。RNA测试确定了使用远处的隐性受体部位引起的异常转录本。这两个变体都会增加神秘受体上游隐秘的多吡啶氨酸段中的嘧啶含量。多嘧啶界是受体剪接位点识别中的重要组成部分，但据我们所知，尚未据报道隐性多吡啶氨酸裂纹激活作为异常剪接的机制。变体5＆6 -BRCA2 [C.6816_6841+1534DEL1560; c.6762delt]和APC c.1042c> t（p.R3248*）预计由于过早终止密码子（PTC）而导致无义介导的衰减（NMD），因此根据ACMG指南将其归类为致病性。然而，RNA测试表明，这些变体引起了框架内的剪接事件，从而去除了PTC，这一发现与载体中相关的基因 - 疾病表型不存在一致。变体7- lztr1 c.2232g> a（p.a744a）是一种高频同义词，位于内含子的下游，它通过毫无常见的U12剪接体剪接。RNA测试表明，新型U2受体位点经常与现有的上游，隐秘的U2供体站点一起使用，但仅在某些个体中。其他具有低级异常剪接的概率对于弱化隐秘的U2供体部位的常见多态性是纯合的。结论：据我们所知，这是影响内含子的U2/U12-身份的单个核苷酸变化的第一个例子，它也例证了转录组中的个体变异性。
双重靶向CRISPR-CASRX在体外和体内降低了C9orf72 ALS/FTD感官和反义重复RNA
额颞痴呆（FTD）和肌萎缩性侧索硬化症（ALS）的最常见遗传原因是G 4 C 2重复扩展在C9orf72基因的内含子中。这种重复的扩展经历了双向转录，产生了感觉和反义重复的RNA物种。在所有阅读帧中，有义务和反义的重复RNA都经历重复相关的非AUG翻译，以生成五种不同的二肽重复蛋白（DPRS）。重要的是，毒性与感官和反义重复衍生的RNA和DPR既相关。这表明针对感官和反义重复RNA可能会提供最有效的治疗策略。涉及RNA的CRISPR-CAS13系统为同时定位多个RNA转录本的途径提供了有希望的途径，因为它们成熟了自己的引导阵列，因此可以从单个构造中靶向一个以上的RNA物种。我们表明，源自Ruminococcus flavefaciens（CASRX）的CRISPR-CAS13D可以成功地将C9orf72 sense和反义重复记录和DPR降低到过度表达C9orf72重复的HEK细胞中的背景水平。CRISPR-CASRX还显着降低了三种独立的C9ORF72患者衍生的IPSC-神经元系中的内源性和反义重复RNA和DPR，而没有可检测到的脱靶效应。为了确定CRISPR-CASRX在体内是否有效，我们使用AAV递送处理了两种不同的C9orf72重复小鼠模型，并观察到在有意义和反义重复的转录本上都显着降低。这项工作共同介绍了将RNA靶向CRISPR系统作为C9ORF72 ALS/FTD的治疗方法的潜力。