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Cre/lox 调节条件性救援和失活......
摘要 在空间和时间上调节基因活性的能力对于研究发育过程中以及胚胎后过程和疾病模型中的细胞类型特异性基因功能至关重要。Cre/lox 系统已广泛用于对斑马鱼的基因功能进行细胞和组织特异性条件分析。然而，缺乏简单有效的分离稳定的 Cre/lox 调控斑马鱼等位基因的方法。在这里，我们应用了我们的 GeneWeld CRISPR-Cas9 靶向整合策略来生成可提供强大条件失活和拯救的 floxed 等位基因。通用靶向载体 UFlip 具有用于克隆位于 floxed 2A-mRFP 基因陷阱两侧的短同源臂的位点，被整合到 rbbp4 和 rb1 的内含子中。 rbbp4 off 和 rb1 off 整合等位基因导致强烈的 mRFP 表达、内源基因表达减少 99% 以上，并重现已知的 indel 功能丧失表型。Cre 的引入导致 floxed 盒的稳定倒位、mRFP 表达的丧失和表型挽救。rbbp4 on 和 rb1 on 整合等位基因与功能丧失突变相结合不会引起表型。Cre 的添加通过盒的稳定倒位、基因捕获和 mRFP 表达以及预期的突变表型导致条件性失活。神经祖细胞 Cre 驱动器用于条件性失活和表型拯救，以展示如何在特定细胞群中使用这种方法。这些结果共同验证了一种在斑马鱼中有效分离 Cre/lox 反应条件等位基因的简化方法。我们的策略为生成基因嵌合体提供了一种新的工具包，并代表了斑马鱼遗传学的重大进步。
DNA 拓扑异构酶 IIα 剪接变体对获得性的影响...
摘要 DNA 拓扑异构酶 II α (170 kDa, TOP2 α /170) 诱导增殖细胞中瞬时 DNA 双链断裂，以解决染色体凝聚、复制和分离过程中的 DNA 拓扑纠缠。因此，TOP2 α /170 是抗癌药物的主要靶点，其临床疗效常常因化学耐药性而受到影响。尽管已经确定了许多耐药机制，但人类癌细胞系对 TOP2 α 界面抑制剂/毒药的获得性耐药通常与 Top2 α /170 表达水平的降低有关。我们实验室最近的研究，结合其他研究人员的早期发现，支持以下假设：对 TOP2 α 靶向药物的获得性耐药的主要机制是由于替代的 RNA 加工/剪接。具体而言，已报道了几种 TOP2 α mRNA 剪接变体，它们保留了内含子，并被翻译成缺乏核定位序列的截短 TOP2 α 异构体，随后导致核质分布失调。此外，内含子保留可能导致截短异构体缺乏核定位序列和活性位点酪氨酸 (Tyr805)，而活性位点酪氨酸是形成酶-DNA 共价复合物所必需的，并且在存在 TOP2 α 靶向药物的情况下诱导 DNA 损伤。最终，这些截短的 TOP2 α 异构体导致药物对细胞核中的 TOP2 α 的活性降低并表现出耐药性。因此，对调节 TOP2 α 前 mRNA 的替代 RNA 加工的机制的完整表征可能会产生新的策略来规避获得性耐药性。此外，新型 TOP2 α 剪接变体和截短的 TOP2 α 同工型可用作药物耐药性、预后和/或直接未来 TOP2 α 靶向治疗的生物标志物。
利用 CRISPR/Cas9 基因编辑系统创建新的果蝇 X 染色体平衡子 First Multiple 8 (FM8)
一个广泛使用的具有较长非倒置片段的平衡子的重要例子是 X 染色体平衡子 First Multiple 7 (FM7, Merriam 1968)，其中在 FM7c 染色体上发现的雌性不育突变 singed, sn X2 因 4E1-11F2 倒位内的双交叉事件而多次丢失 (Miller et al. 2016a)。我们研究了该区域中的几个雌性不育基因和雌性致死基因（例如 ovo 、 snf 、 Sxl 、 otu ； Grammates et al. 2022），并希望实现更好的平衡。由于我们使用的这些基因的等位基因在雄性中可存活且可育，因此我们希望平衡子具有半合子和纯合致死性。为了构建更好的平衡子，我们利用了 CRISPR/Cas9 基因组编辑系统 (Ren 等人 2013；Port 和 Bullock 2016；Benner 和 Oliver 2018)，针对 FM7c 的这个大型有问题的倒位 (4E1-11F2，图 1B)。这个片段中的新倒位将更好地抑制此区域内的双交叉事件。为了有目的地设计一个新的倒位，我们想要在 4E1-11F2 片段内创建一个断点，并在 FM7c 上此片段外的另一个区域创建一个断点。我们决定在 FM7c 平衡子染色体中的 cut (ct，在 4E1-11F2 内，图 1B) 处进行倒位，这是一个必需基因，但具有可行的等位基因，以及 white a (wa，在 4D7-1B3 内，图 1B)。为了实现这一目标，我们创建了一个多顺反子 CRISPR gRNA 构建体（Port 和 Bullock 2016；Benner 和 Oliver 2018），其中包含两个针对 wa 第一个内含子的 gRNA（Grammates 等人 2022）和两个针对 ct 和 ct 6 之间区域的 gRNA
微生物生物技术
1。为学生提供有关基因组学和蛋白质组学的基本知识2。对基因组映射，结构/功能基因组学，基因组学和蛋白质组学涉及的技术的广泛知识。课程内容单元1：OMICS的基因和基因组介绍；基因组学类型；基因：orf;外显子；内含子；原核，真核和线粒体/叶绿体基因组； shot弹枪DNA测序； c-value＆paradox;人类基因组项目。单元2：基因组图和分析基因组映射的基因表达类型；涉及基因组图和基因表达分析的技术（RFLP，RAPD，SSCP，SSLP，STS，RT-PCR； DD-PCR，SNP，FISH，FISH，NUCLEASE保护测定，分子杂交）。单元3：蛋白质组学概念和蛋白质组成分的基础；蛋白质组学在生物学功能中的重要性；蛋白质 - 蛋白质相互作用和研究它的方法：蛋白质阵列，交叉链接方法，亲和力方法，酵母杂种系统。单元4：蛋白质质谱法（MS）的质谱分析 - 肽质量指印，质量精度，分辨率，灵敏度；离子来源：电喷雾电离，基质辅助激光解吸和电离；质量分析仪：四极，离子陷阱，飞行时间，圆形，傅立叶 - 转换离子回旋共振，混合分析仪；探测器； MS-MS; LC-MS。教科书：-1。基因组分析和基因组学原理S.B. Primrose和R.M. Twyman，第三版（Blackwell Publishing）。2。Liebler，“蛋白质组学简介” Humana出版社3。Conard，爱德华。 基因组学。 2.Pennington，SR，Dunn MJ，“蛋白质组学：功能的蛋白质序列”。Conard，爱德华。基因组学。2.Pennington，SR，Dunn MJ，“蛋白质组学：功能的蛋白质序列”。Apple Academics参考书：-1。ODD RW，Primrose SB，“基因操纵原理，基因工程概论”，Blackwell Science Publications。viva书3.生物技术的质谱法：Gary Siuzdak。
CRISPR Prime编辑的自动设计，用于56,000人的病原变体
Neoformans是真菌性脑膜炎的最常见原因，是一种基础性菌群单倍体发芽的酵母，具有完整的性周期。通过生物学转化和长长的同源臂，通过同源重组进行基因组修饰是可行的，但是该方法是艰巨而不可靠的。最近，多个小组报道了使用CRISPR-CAS9作为生物学的替代方案，但仍然有必要使用长期的HOMOLOG ARM，从而限制了该方法的实用性。由于在先前研究中使用的链球菌CAS9衍生物在Neoformans中没有选择用于表达，因此我们设计，合成并测试了全梭状芽胞杆菌（C. neoformans）的全念珠菌（CNO）Cas9。我们发现，CAS9仅带有常见的Neoformans密码子和共有的C. Neoformans内含子以及TEF1启动子和终结器以及核定位信号（CNO Cas9或“ CNOCAS9”）可靠地可靠地在C. Neoformans菌株中可靠地编辑基因组。此外，使用带有短（50bp）同源臂的供体来完成编辑，这些捐赠者附着于标记DNA上，这些供体与合成的寡核苷酸和PCR扩增一起产生。我们还证明，先前的CNOCAS9稳定整合进一步增强了转移和同源重组效率。重要的是，这种操作不会影响动物的毒力。我们还建立了一个通用标记的模块，该模块具有密码子优化的荧光蛋白（Mneongreen）和一个串联的钙调蛋白结合肽-2X标志标签，允许对蛋白质进行本地化和纯化研究，以对相应的基因进行简短授权的重新构造对相应的基因进行修改。这些工具使Neoformans中的短体系基因组工程能够。
生成Zeb2不足的人IPSC线（...
智力残疾，癫痫，赫希斯普朗氏病和各种先天性畸形（Garavelli and Mainardi，2007年）。此外，Zeb2的过表达与不同形式的癌症的进展有关（Fardi等，2019）。虽然已经对Zeb2蛋白的功能进行了广泛的研究，但目前缺乏可用的Zeb2缺乏的人类细胞模型，无法在胚胎发育过程中进一步删除Zeb2依赖性调节网络，并且可以取消抗癌药物的发展。为此，我们使用CRISPR/CAS9介导的编辑系统生成了人类IPSC线，耗尽了Zeb2蛋白（表1）。我们分别应用了两个靶向Zeb2外显子5和外显子6的GRNA（图1 a），在父母IPSC线上Kicri002a（表1;（Uhlin等，2017）。通过LiPofection将包含两个GRNA的构建体引入IPSC系，并通过荧光激活的细胞分选（FACS）选择转染的细胞以表达绿色荧光蛋白。单细胞克隆在LN521上扩展，并通过基因组DNA上的Sanger测序分析基因编辑。分析显示了具有纯合790 bp缺失的克隆线kicri002a-4，跨越了内含子5和外显子5和6的一部分（chr2：g.144,404,077 - 144,404,404,404,867del;1 a;补充。图1 A-B）。 外显子5和外显子6的其余部分被融合，预测氨基酸194上的截短的Zeb2 mRNA，其截短的Zeb2 mRNA（PTC）（P.THR188888888888888888888888;图1 A-B）。外显子5和外显子6的其余部分被融合，预测氨基酸194上的截短的Zeb2 mRNA，其截短的Zeb2 mRNA（PTC）（P.THR188888888888888888888888;图1 a）。与136PTC位于编码N末端锌指（NZF）域的区域以及更C末端的R-SMAD结合域（SBD），CTBP相互作用结构域（CID）（CID）和C-末端的c-terminal Zinc Zinc Finger（CZF（CZF）和Homeododomain（例如Domains）（epifa）（epifa）。
果蝇中的单个转录本的组合遗传扰动的多顺基因转基因设计
捕获人类疾病遗传复杂性并允许对基础细胞，组织和器官相互作用进行机械探索的实验模型对于使我们对疾病生物学的理解至关重要。这样的模型需要对多个基因的组合操作，通常是一次以上的组织。在体内进行复杂的遗传操作的能力是果蝇的关键优势，其中许多用于复杂和正交遗传扰动的工具。然而，在这些已经复杂的遗传背景中建立更多代表性疾病模型和进行机械研究所需的大量转基因是具有挑战性的。在这里，我们提出了一种设计，该设计通过允许靶向组合异位表达和来自单个诱导型转基因的多个基因敲低的靶向组合异位表达来推动果蝇遗传学的极限。由该转基因编码的多余体转录本包括一个合成的短发夹簇，它克隆在转录本的5'末端的内含子中，然后是两个蛋白质编码序列，该蛋白质编码序列由介导核糖体跳过的T2A序列分开。这项技术对于建模癌症等遗传复杂疾病特别有用，癌症通常涉及多发性肿瘤基因的同时激活和多PLE肿瘤抑制剂的丧失。此外，将多种遗传扰动巩固到single转基因中，进一步简化了执行组合遗传操作的能力，并使其很容易适应广泛的转基因系统。这种用于组合遗传扰动的灵活设计也将是一种有价值的工具，用于探索从人类疾病的OMICS研究中鉴定出的多基因基因特征并创建人源化的果蝇模型，以表征人类基因中与疾病相关的变体。它也可以适用于研究正常组织稳态和发展需要同时操纵许多基因的生物学过程。
分子生物科学研究所
番茄（Solanum lycopersicum）是全球最重要的作物之一，但其生产力越来越受到全球变暖引起的热应激的威胁。了解番茄热应激反应背后的机制对于制定面对气候变化时增强其韧性的策略至关重要。热应激反应的关键方面是编码热休克蛋白（HSP）的基因的激活，该基因充当分子伴侣，以防止蛋白质折叠和有毒骨料形成。这一过程以及许多其他与热耐碳相关的基因的转录是由热应力转录因子（HSF）驱动的。前mRNA剪接是调节基因表达的重要机制，许多基因响应热应激而进行了替代剪接。然而，在高温下调节替代剪接的机制以及剪接因子在耐热性中的贡献仍然很少了解。丝氨酸/精氨酸（SR）蛋白的成员不仅在植物中，而且在哺乳动物中也被视为替代剪接的核心调节剂。我们的小组最近表明，RS2Z35和RS2Z36是热应激期间替代剪接的重要调节剂。我们已经鉴定出SR46A，这是一种具有两个RS结构域的SR样蛋白，HS高度诱导了热应激敏感性替代剪接的另一个重要调节剂。CRISPR/CAS9介导的突变导致几种基因的表达改变，包括许多HSF和降低热耐耐受性。RNA-seq数据分析确定了在热应激响应的不同阶段中由SR46A调节的差异表达和剪接基因。有趣的是，与RS2Z蛋白相比，SR46A调节了不同的HSF集，因为SR46A的敲除可增强内含子保留率，而与敲除RS2Z基因敲除所致的剪接相反。这些发现提供了对应激适应为基础的分子机制的新见解，并将SR46A识别为番茄替代剪接的核心调节。
环境DNA作为生物多样性监测的互补工具：一种多技术和多营养学方法，用于研究鲸类分布和进食生态学
基础模型在几个领域取得了巨大的成功，例如自然语言处理，计算机视觉和最近的生物学。DNA粉底模型尤其是作为基因组学有前途的方法而出现的。然而，到目前为止，尚无模型在广泛的基因组和调节元素上提供了核苷酸级预测，从而限制了它们的实际实用性。在本文中，我们基于以前在核苷酸跨前（NT）上的工作，以开发分割模型分割，该模型将处理至30kb-long的输入DNA序列，以预测单核苷酸分辨率下的14种基因组元素类别类别。通过利用NT的预训练权重，分段超过了几种消融模型的性能，包括具有单热编码的核苷酸序列和从SCRATCH训练的模型的卷积网络。分段可以使用零射线通用的多个序列长度来处理高达50kb的序列。我们在整个基因组的剪接位点检测中显示出改善的性能，并表现出强核苷酸水平的精度。因为它同时评估所有基因元件，因此分段可以预测序列变体对剪接位点变化的影响，而且还可以预测转录本相工相的外显子和内含子重排的影响。最后，我们表明，对人类基因组元素进行训练的分段模型可以推广到不同的人和植物物种的元素，并且训练有素的多种阶段分段模型可以实现对不见物物种的所有基因元素的更强的概括。总而言之，分段表明DNA粉底模型可以在单核苷酸分辨率下处理基因组学中复杂的颗粒状任务。分段可以很容易地扩展到其他基因组元素和物种，从而代表了我们分析和解释DNA的新范式。我们使我们的jax的github存储库中可在pytorch的jax和huggingface空间上提供分段-30kb的人类和多物种模型。
分段通知 - 基因组 - 核苷酸 -
基础模型在几个领域取得了巨大的成功，例如自然语言处理，计算机视觉和最近的生物学。DNA粉底模型尤其是作为基因组学有前途的方法而出现的。然而，到目前为止，尚无模型在广泛的基因组和调节元素上提供颗粒状的核苷酸水平预测，从而限制了其实际实用性。在本文中，我们基于以前在核苷酸变压器（NT）上的工作，以开发一个分割模型，即分割，该模型在单核苷酸分辨率下处理输入DNA序列的输入DNA序列，以预测14个基因组学元素的14种基因组学元素。通过利用NT的预训练权重，分段超过了几种消融模型的性能，包括具有单热编码的核苷酸序列和从SCRATCH训练的模型的卷积网络。分段可以处理多个序列的多个序列长度，以零拍概括，以达到50kbp的序列。我们在整个基因组的剪接位点检测中显示出改善的性能，并表现出强核苷酸水平的精度。因为它同时评估了所有基因元素，因此分段可以预测序列变体对剪接位点变化的影响，而且还可以预测转录本同工型中外显子和内含子重排的影响。最后，我们表明，对人类基因组学元素进行训练的分段模型可以推广到不同物种的元素，并且训练有素的多种属性分段模型可以实现对不见物物种的所有基质元素的更强的一般性。总而言之，分段表明DNA粉底模型可以在单核苷酸分辨率下处理基因组学中复杂的颗粒状任务。分段很容易扩展到其他基因组学元素和物种，因此代表了我们分析和解释DNA的新范式。我们使我们的jax的github存储库中可在pytorch的jax和huggingface空间上提供分段-30kb的人类和多物种模型。