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RBM20 获得功能性心肌病突变重新连接剪接调控并重新分配处理体内的核糖核蛋白颗粒
心脏剪接因子 RBM20 的突变会导致恶性扩张型心肌病 (DCM)。为了了解 RBM20 相关 DCM 的机制，我们设计了具有 DCM 相关 RBM20 错义突变的同源 iPSC 以及 RBM20 敲除 (KO) iPSC。由这些细胞系制成的 iPSC 衍生的工程心脏组织重现了 RBM20 相关 DCM 的收缩功能障碍，并且显示错义突变的功能障碍比 KO 更严重。通过 eCLIP 对 RBM20 RNA 结合的分析表明，突变型 RBM20 对与肌萎缩侧索硬化症 (ALS) 和加工体相关 RNA 结合蛋白 (FUS、DDX6) 共享的 3′UTR 序列具有功能获得偏好。深度 RNA 测序表明，RBM20 R636S 突变体具有独特的基因、剪接、多聚腺苷酸化和环状 RNA 缺陷，与 RBM20 KO 不同。超分辨率显微镜验证了突变体 RBM20 保持非常有限的核定位潜力；相反，突变蛋白在基础条件下与细胞质加工体 (DDX6) 结合，在急性应激后与应激颗粒 (G3BP1) 结合。总之，我们的结果强调了通过剪接依赖和非剪接途径导致心脏疾病的致病机制。
科学期刊-IU Indianapolis Scholarworks
阿尔茨海默氏病（AD）是具有复杂起源的老年人中的主要痴呆症。尽管广泛研究了与AD相关的蛋白质编码基因，但非编码RNA（NCRNA）和转录后修饰（PTM）的参与尚不清楚。在这里，我们全面地描述了来自西奈山/ JJ山彼得斯·彼得斯医学中心大脑脑库研究和蛋黄酱的1460个大脑区域中NCRNA和PTM事件的景观，包括33,321个长NCRNAS，ncrnas，92,897 Enternative Enternation and Hancer rnas，53，763，763，763，763，763 3,763， A到I RNA编辑事件。我们还确定了25,351个异常表达的NCRNA，并改变了与AD性状相关的PTM事件，并进一步鉴定了相应的蛋白质编码基因来构建调节网络。此外，我们开发了一个用户友好的数据门户，Adatlas，促进用户探索我们的结果。我们的研究旨在为AD中的NCRNA和PTM建立一个综合数据平台，以推动相关研究。
使用通用供体
图1。通过MESC中的刺激诱导的插入诱变。（a）击球策略的示意图。通过Cas9 RNP的hit-trap供体和基因组的同时裂解会导致靶向捕获。 整合后，基因陷阱盒会导致靶基因启动子的截短蛋白和GFP的表达。 选择盒子由组成型SV40启动子表达紫霉素的抗性基因。 ATS序列：GGTATGTCGGGAACCTCTCCAGG; SA，剪接受体； IRES，内部核糖体入口网站； PA，聚腺苷酸信号。 （b）在杀击球中选择呼吸霉素后MESC克隆的代表性微观图像。 红色箭头分别指示凋亡克隆（顶部），GFP-生存的克隆（中间）和GFP阳性幸存的克隆（底部）。 比例尺，50 µm。 （c）GFP阳性克隆的PCR基因分型证实了HPRT基因座的hit-trap供体的正确整合。 5 /3J，5' /3'交界处。 （d，e）针对HPRT基因座（TH1-1，TH2-4和TH3-5）的hit-trap克隆的Western印迹和QPCR分析，并用微管蛋白作为负载对照。 错误条显示了S.D. 来自三个技术重复。 使用学生的未配对t检验来计算显着性：** p <0.01。通过Cas9 RNP的hit-trap供体和基因组的同时裂解会导致靶向捕获。整合后，基因陷阱盒会导致靶基因启动子的截短蛋白和GFP的表达。选择盒子由组成型SV40启动子表达紫霉素的抗性基因。ATS序列：GGTATGTCGGGAACCTCTCCAGG; SA，剪接受体； IRES，内部核糖体入口网站； PA，聚腺苷酸信号。（b）在杀击球中选择呼吸霉素后MESC克隆的代表性微观图像。红色箭头分别指示凋亡克隆（顶部），GFP-生存的克隆（中间）和GFP阳性幸存的克隆（底部）。比例尺，50 µm。（c）GFP阳性克隆的PCR基因分型证实了HPRT基因座的hit-trap供体的正确整合。5 /3J，5' /3'交界处。（d，e）针对HPRT基因座（TH1-1，TH2-4和TH3-5）的hit-trap克隆的Western印迹和QPCR分析，并用微管蛋白作为负载对照。错误条显示了S.D.来自三个技术重复。使用学生的未配对t检验来计算显着性：** p <0.01。
基因表达的转录和转录法规
抽象转录和转录后调节是控制基因表达的一个基本过程，可以使细胞在维持稳态的同时适应环境变化。这种调节的破坏会导致各种遗传疾病，包括癌症和神经退行性疾病。本文的目的是检查转录和转录后调节的机制，及其对分子生物学和生物医学的影响。本文通过收集PubMed，ScienceDirect和NCBI数据库的数据使用文献综述方法。分析，以识别关键因素，例如启动子，增强子，消音器，RNA聚合酶II以及转录阶段，包括启动，伸长和终止，以限定，限制，尾声，裁缝和拼接。审查表明，转录调节始于涉及转录因子和RNA聚合酶II的预启用复合物的形成。在伸长过程中，RNA合成以高度的加工性进行。在转录后阶段，修饰，例如在5'末端添加7-甲基鸟苷，而在3'末端的聚腺苷酸化则增加了mRNA的稳定性。此外，剪接机制允许从单个基因形成不同蛋白质。该调节可确保基因表达在细胞要求的适当时间，位置和数量上发生。在转录后阶段，修饰，例如在5'末端添加7-甲基鸟苷和3'末端的聚腺苷酸化增加了mRNA的稳定性。剪接机制允许从单个基因形成不同蛋白质。该调节可确保根据细胞的需求在适当的时间，位置和数量上发生基因表达。抽象转录和转录后调节是控制基因表达的基本过程，可以使细胞在维持稳态的同时适应环境变化。该调节的疾病会引发各种遗传疾病，包括癌症和神经退行性疾病。撰写本文旨在检查转录和转录后调节的机制，及其对分子和生物医学生物学的影响。Div>使用文献审查方法编写文章，通过收集PubMed，ScienceDirect和NCBI数据库的数据。进行分析以识别主要要素，例如启动子，增强子，消音器，RNA聚合酶II以及转录阶段，包括启动，伸长和终止，以及转录后的转录机制，例如封盖，裁缝和固定。审查结果表明，转录调控始于涉及转录因子和RNA聚合酶II的预启示复合物的形成。在伸长过程中，RNA合成以高水平的处理。在转录后阶段，诸如5'结束时添加7-甲基鸟苷的修改以及3'结束时的多额质量增加了mRNA稳定性。剪接机制还允许从一个基因形成不同的蛋白质。该调节可确保根据细胞需求及时，位置和数量进行基因表达。
基于 CRISPR/Cas9 的非洲锥虫血液中必需基因的精准标记
目的蛋白质经常用融合标签来表达，以方便实验分析。在通常为二倍体的锥虫中，标签编码 DNA 片段通常与一个天然等位基因融合。然而，由于重组细胞在转染后占群体的 0.1% 以下，这些 DNA 片段还包含一个标记盒用于正向选择。因此，天然 mRNA 非翻译区 (UTR) 被替换，可能会扰乱基因表达；在锥虫中，UTR 通常会在广泛和组成性多顺反子转录的背景下影响基因表达。我们试图开发一种标记策略，以保留血流形式非洲锥虫的天然 UTR，在这里我们描述了一种基于 CRISPR/Cas9 的敲入方法来驱动精确和无标记的必需基因标记。使用简单的标签编码扩增子，我们标记了四种蛋白质：组蛋白乙酰转移酶，HAT2；组蛋白去乙酰化酶，HDAC3；切割和多聚腺苷酸化特异性因子 CPSF3；以及变体表面糖蛋白排除因子 VEX2。该方法保留了天然 UTR，并产生了表达功能性重组蛋白的克隆菌株，通常两个等位基因都被标记。我们展示了基于免疫荧光的定位和富集蛋白质复合物的实用性；在本例中是 GFP HAT2 或 GFP HDAC3 复合物。这种精确标记方法有助于组装表达必需重组基因的菌株，同时保留其天然 UTR。
nucana14sept2024 1
关于Nucana nucana是一家临床阶段的生物制药公司，致力于通过应用我们的素食技术将某些最广泛处方的化学疗法剂，核苷类似物（核苷类似物）转化为更有效和更安全的药物，从而显着改善了癌症患者的治疗结果。虽然这些常规药物仍然是治疗许多固体和血液学肿瘤的护理标准的一部分，但它们具有巨大的缺点，可以限制其疗效，并且通常耐受性不佳。利用我们的专有技术，我们正在开发新的药物，旨在克服核苷类似物的关键局限性，并在癌细胞中产生更高浓度的抗癌代谢物。nucana的管道包括nuc-3373和nuc-7738。nuc-3373是一种源自核苷类似物5-氟尿嘧啶的新化学实体，这是一种广泛使用的化学疗法。nuc-3373目前正在进行的两项正在进行的临床研究中进行评估：一项1B/2期研究（NUTIDE：302）与转移性结直肠癌患者中的白细胞蛋白，伊立曲霉或奥沙利铂结合使用；以及NUC-3373的1B/2期模块化研究（NUTIDE：303）与PD-1抑制剂Pembrolizumab结合使用，用于晚期实体瘤患者，并与多西他赛为肺癌患者结合使用。nuc-7738是一种新型的抗癌剂，破坏RNA聚腺苷酸化，深刻影响癌细胞中的基因表达，并靶向肿瘤微环境的多个方面。nuc-7738在1/2期研究的第2阶段（nutide：701）中，该研究评估了黑色素瘤患者的晚期实体瘤患者的NUC-7738作为一种单一疗法，并与Pembrolizumab结合使用。
剪接靶向药物强调内含子保留是晚期前列腺癌的一个可操作弱点
摘要背景晚期前列腺癌 (PC) 的特点是对雄激素剥夺疗法和化疗不敏感，导致大多数患者的预后不良。因此，晚期 PC 迫切需要新的治疗策略。越来越多的证据表明剪接失调是晚期 PC 的标志。此外，药物抑制剪接过程正在成为治疗这种疾病的一个有希望的选择。方法通过使用代表性的雄激素不敏感 PC 细胞系 (22Rv1)，我们研究了三种剪接靶向药物：Pladienolide B、indisulam 和 THZ531 产生的细胞毒作用背后的全基因组转录组效应。进行了生物信息学分析以揭示对这些治疗的转录和剪接调控敏感性背后的基因结构特征。通过基因本体分析注释了这些治疗改变的生物途径，并通过细胞模型中的功能实验进行了验证。结果尽管 Pladienolide B、indisulam 和 THZ531 对晚期 PC 细胞具有相似的细胞毒作用，但它们会调节特定的转录和剪接特征。药物敏感性与受调控的外显子和内含子中不同的基因结构特征、表达水平和顺式作用序列元素有关。重要的是，我们确定了与 PC 相关的基因 (即 EZH2、MDM4)，其药物诱导的剪接改变会对细胞存活产生影响。此外，计算分析发现剪接靶向药物对内含子保留有广泛影响，并且在与前 mRNA 3' 端加工有关的基因 (即 CSTF3、PCF11) 中富集。与此相符的是，晚期 PC 细胞对裂解和多聚腺苷酸化复合物的特定抑制剂表现出高度敏感性，这增强了已经用于治疗这种癌症的化疗药物的效果。结论 我们的研究发现内含子保留是晚期前列腺癌的一个可操作弱点，可以利用它来改善这种目前无法治愈的疾病的治疗管理。关键词 晚期前列腺癌、剪接抑制剂、可变剪接、内含子保留、3'-末端 mRNA 加工、转录组学
使用CRISPR/CAS9与同源指导的修复来使人拓扑异构酶IIα内含子19 5'剪接位点保持沉默：人类白血病K562细胞中依托泊苷耐药性的产生
DNA拓扑异构酶IIα（TOP2α /170）是增殖细胞必不可少的酶。为了说话繁殖恶性肿瘤，这使Top2α /170成为依托泊苷和其他临床活性抗癌药物的重要靶标。这些药物的功效通常受到与TOP2α /170表达水平的改变有关的情况的限制。我们的实验室最近显示出TOP2α /170的水平降低，并且由于内含子的聚腺苷酸化（IPA;内含子19）在获得的可获得的依托托糖苷抗性K562 k562 k562 clonal细胞系中，C末端截短的90 kDa同工型TOP2α /90降低了TOP2α /90。我们先前报道说，这种同工型用TOP2α /170异构二聚体是对依托泊苷的耐药性的决定因素。通过基因编辑恢复的TOP2α /170水平，在耐药K /VP.5细胞中优化耐药的K /VP.5细胞中的剪接位点，TOP2α /90表达降低，并降低了耐药性。通过CRISPR /CAS9对父母K562细胞中的外显子19 /内含子进行沉默，并通过同源指导修复（HDR）进行沉默，从而迫使内含子19保留，从而诱导抵抗力，从而诱导抵抗力，从而破坏正常的RNA处理（即进一步评估90 nir and 2 and 2 and 2 and 2）同工型作为抗性决定因素。通过定量聚合酶链反应（QPCR）鉴定基因编辑的克隆，并通过Sanger测序验证。RNA-SEQ和QPCR研究表明，内含子19保留导致TOP2α编辑的mRNA转录物的降解导致TOP2α /170的表达降低。TOP2α / 170 mRNA /蛋白质表达水平在TOP2α基因编辑的克隆中衰减，这会导致对依托泊苷的耐药性，如依托泊苷诱导的DNA损伤（γH2AX，彗星测定）和生长抑制所评估。在基因编辑的K562细胞中TOP2α /90的强制表达进一步降低了依托泊苷诱导的DNA损伤，以支持该截短的同工型的主要负面作用。共同支持TOP2α /170和Top2α /90作为对TOP2α-靶向剂的灵敏度 /耐药性的重要作用。
蛋白质合成流图
蛋白质合成是在所有生物体中发生的重要细胞过程，涉及蛋白质的产生。此复杂的过程由两个阶段组成：转录和翻译。转录发生在细胞核内，DNA充当产生信使RNA的模板（mRNA）。mRNA然后传播到细胞质的核糖体，这是翻译的位置。在这里，mRNA携带的遗传信息被解码以合成多肽链。**转录**是蛋白质合成的初始阶段，其中DNA的遗传密码被转录为mRNA。当RNA聚合酶附着在基因的启动子序列上时，此过程就开始了，促使DNA放松。酶然后读取DNA碱基并组装互补的mRNA链。用作模板的DNA链被称为模板或反义链，而其对应物是非编码或感官链。新形成的mRNA链反射了编码DNA链，尿嘧啶代替了胸腺素。**处理mRNA **涉及新合成的mRNA的进一步细化，也称为前mRNA。在它可以将细胞核作为成熟的mRNA退出之前，它会经历剪接，编辑和聚腺苷酸化，从而改变mRNA以准备翻译。对于有兴趣可视化此过程的人，**蛋白质合成流程图**可以是一个有用的工具。它提供了从DNA转录到最终蛋白质产物的蛋白质合成每个步骤的清晰结构化表示。此外，mRNA经过编辑，改变了某些核苷酸。这样的流程图可以帮助理解基于这种基本生物学功能的复杂相互作用和机制。遗传修饰增强了单个基因的多功能性，使其能够产生多种蛋白质。这是通过称为剪接的过程来实现的，该过程从蛋白质合成流程图中描述了从信使RNA（mRNA）中去除被称为内含子的非编码区域。剪接的mRNA仅由编码区域或外显子组成，这直接有助于蛋白质合成。核糖核蛋白，核中含有RNA的小蛋白，可促进该剪接。例如，由于这种编辑，参与血液中脂质转运的APOB蛋白以两种形式存在。较小的变体是由于插入的停止信号截断了mRNA的插入信号。5'上限过程为mRNA的铅端增加了一个保护性的甲基化盖，从而保护了它免于降解和辅助核糖体附着。一系列腺嘌呤碱基的尾巴标志着mRNA的结论，在其核出口和防御降解酶的防御中发挥了作用。分子生物学的中心教条概述了从RNA到蛋白质的过渡，这一过程称为翻译。这涉及将mRNA中的遗传代码读取以合成蛋白质，如流程图所示。后加工，mRNA将核和核糖体缔合，由核糖体RNA（rRNA）和蛋白质组成。核糖体解密mRNA序列，而转移RNA（tRNA）分子依次传递适当的氨基酸。翻译分为三个阶段：启动，伸长和终止。在开始期间，现在在细胞质中的mRNA与甲基化帽和起始密码子位点的核糖体亚基结合。具有与起始密码子连接的具有匹配的反物质的tRNA，形成了起始复合物。伸长涉及连续供应氨基酸的TRNA，这些氨基酸被添加到新生的多肽链中。每个tRNA转移后其氨基酸后出发，使核糖体沿mRNA进行进展，从而为下一个tRNA腾出空间。这种系统的添加氨基酸构建了多肽，直到该过程结束为止。蛋白质合成是一个重要的细胞过程，最终导致蛋白质的产生。它在两个主要阶段展开：转录和翻译。在转录过程中，DNA的遗传密码被转录为核中的信使RNA（mRNA），包括三个阶段：启动，伸长和终止。mRNA然后将这些遗传指令传输到发生翻译的细胞质核糖体。由核糖体RNA（RRNA）和蛋白质组成的核糖体读取mRNA序列。转移RNA（tRNA）分子根据mRNA代码将适当的氨基酸带入核糖体。rRNA促进了这些氨基酸的粘结，形成了多肽链。该链可能会进一步进行合成后修饰以实现其最终蛋白质结构。mRNA退出核之前，它会经过加工，成为准备翻译的成熟转录本。蛋白质合成的过程与分子生物学的中心教条一致，该过程映射了生物系统中遗传信息的流动。合成后，多肽链可能会折叠成特定的形状，与其他分子相互作用，或在内质网中进行其他修饰以实现其指定的功能。