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康斯坦斯改变了拟南芥的昼夜节律
植物是无柄生物，已经获得了高度塑料发育策略以适应环境。在这些过程中，口腔过渡对于确保生殖成功至关重要，并且受到多个内部和外部遗传网络的最终调节。控制植物对白天长度的响应的光周期途径是控制流动的最重要的途径之一。在ara-bidopsis光周期旋转中，constans（CO）是中心基因，它在漫长的一天结束时在叶片中激活了叶片开花基因座t（ft）的表达。昼夜节律强烈地表达了CO的表达。迄今为止，尚无关于从光周期途径回到昼夜节律的反馈回路的证据。使用转录网络，我们确定了相关的网络图案，可以调节昼夜节律之间的相互作用。基因表达，染色质免疫沉淀实验和表型分析使我们能够阐明CO在昼夜节律中的作用。植物具有改变的CO表达的植物显示出不同的内部时钟周期，通过每日叶子节奏运动来衡量。我们表明，通过与启动子上的特定位点结合，CO上调了与昼夜节律时钟相关的关键基因的表达，例如CCA1，LHY，PRR5和GI。CO上的大量PRR5抑制靶基因上调，这可以解释COCo-Prr5复合物与BZIP转录因子HY5相互作用，并有助于将复合物定位在时钟基因的启动子中。总而言之，我们的结果表明，可能有一个反馈循环，可以在其中将循环回到昼夜节律时钟，从而为昼夜节律提供了季节性信息。
优化 ErCas12a 以实现拟南芥中的高效基因编辑
摘要 Er Cas12a 核酸酶，也称为 MAD7，是来自直肠真杆菌的 CRISPR/Cas 系统的一部分，与 Cas12a 核酸酶有远亲关系。由于它与常用的 As Cas12a 仅有 31% 的序列同源性，其知识产权可能不受 Cas12a 核酸酶授予的专利权的保护。因此，Er Cas12a 成为实际应用的一个有吸引力的替代品。然而，Er Cas12a 的编辑效率强烈依赖于靶序列和温度。因此，通过蛋白质工程优化酶活性对于其在植物中的应用尤其有吸引力，因为它们是在较低温度下培养的。基于从 Cas12a 核酸酶优化中获得的知识，我们选择通过引入类似的氨基酸交换来提高 Er Cas12a 的基因编辑效率。有趣的是，这些与 As Cas12a 增强版或 Ultra 版类似的突变均未导致拟南芥中 Er Cas12a 的编辑显著增强。然而，酶假定的 α 螺旋结构中的两个不同突变 V156R 和 K172R 显示出可检测到的编辑改善。通过结合这两个突变，我们获得了改进的 Er Cas12a (im Er Cas12a) 变体，与拟南芥中的野生型酶相比，其活性增加了几倍。该变体在 22°C 时具有很强的编辑效率，通过将培养温度升高到 28°C 可以进一步提高，甚至可以编辑以前无法接近的目标。此外，没有检测到增强的场外活动。因此，im Er Cas12a 是一种经济上有吸引力且有效的植物基因组工程其他 CRISPR/Cas 系统的替代方案。
具有独特作用机理的新型泛-RAS抑制剂可阻止胃肠癌小鼠模型中的肿瘤生长
预印本（未通过同行评审认证）是作者/资助者。保留所有权利。未经许可就不允许重复使用。此版本的版权持有人于2024年1月11日发布。 https://doi.org/10.1101/2024.01.10.574527 doi：Biorxiv Preprint
CRISPR/CAS9的基因组编辑工具箱，用于拟南芥
CRISPR/CAS9系统已成为一种强大的基因组工程工具，用于研究基因功能并改善植物特征。基因组编辑是通过Cas9核酸内切酶在特定的基因组序列上实现的，以产生由短导RNA（SGRNA）指导的双标准断裂（DSB）。DSB通过容易出错的非同源末端连接（NHEJ）或无错误的同源指导修复（HDR）路径来修复，分别导致基因突变或序列替换。这些细胞DSB修复途径可以被利用以敲除或替换基因。另外，胞质或腺嘌呤碱基编辑器（CBES或ABE）融合到催化死亡的Cas9（DCAS9）或Nickase Cas9（NCAS9）（NCAS9）时，也用于执行精确的基础编辑而无需生成DSB。在本章中，我们描述了通过使用基于CRISPR/CAS9的系统在拟南芥基因组中执行单个/多基因突变和精确基础编辑的详细程序。特别是，描述了转基因线的目标基因选择，SGRNA设计，矢量结构，转化和分析的步骤。该方案有可能适应在其他植物物种（例如水稻）中进行基因组编辑。
基于拟南芥的模型如何帮助...
i生物化学与生物物理学研究所波兰科学学院，波兰，波兰，ii玛丽亚·斯克洛多夫斯卡库里国家肿瘤学国家研究研究所，罗恩特纳5 PotsdamGolm, Germany, V Center for Plant Systems Biology and Biotechnology, Plovdiv, Bulgaria, VI MaxPlanck Institute for Plant Breeding Research, CarlvonLinne Weg 10, Cologne, Germany, VII LeibnizInstitut für Pflanzengenetik und Kulturplfanzenforschung Corrensstraße 3, Gatersleben, Germany, VIII国家巨大的国家主要实验室，生命科学学院，河南大学，河南大学，凯芬，中国，IX生物学系，约克大学，约克大学，英国，X MAXPLANCK植物育种研究所，Carlvonlinee Weg 10，Cologne，德国，德国，德国，
聚合酶θ缺陷型拟南芥的基因靶向
几十年来，农杆菌介导的转化一直是生成转基因植物的首选工具。在此过程中，携带转基因的 T-DNA 从细菌转移到植物细胞中，在那里它通过聚合酶θ (Pol h ) 介导的末端连接 (TMEJ) 随机整合到基因组中。通过同源重组 (HR) 将 T-DNA 靶向到特定基因组位点也是可能的，但此类基因靶向 (GT) 事件发生的频率很低，并且几乎总是伴随着随机整合事件。另一个复杂因素是，T-DNA 和目标位点重组的产物可能不仅映射到目标位点 (真正的 GT)，还可能映射到基因组中的随机位置 (异位 GT)。在本研究中，我们通过使用突变了 TEBICHI 基因（该基因编码 Pol h ）的拟南芥，研究了 TMEJ 功能如何影响植物中 GT 的生物学。在 TMEJ 功能强大的植物中，我们主要发现 GT 事件伴随着随机的 T-DNA 整合，而在 teb 突变体背景下获得的 GT 事件缺乏额外的 T-DNA 拷贝，证实了 Pol h 在 T-DNA 整合中的重要作用。Pol h 缺乏也会阻止异位 GT 事件，这表明导致此结果的事件序列需要 TMEJ。我们的研究结果提供了可用于制定在农作物中获得高质量 GT 事件的策略的见解。
拟南芥中脱氧酮诱导的矮人降解的新机制
在被子植物中，斯特龙酮受体是α /β水解酶dwarf14（d14），在strigolactone结合后，经历了构象变化，触发了strigolactone依赖性反应，以及strigolactones。strigolactone信号传导涉及在strigolactone结合的D14，E3-泛素li gase scf max2和转录核心代理SMXL6/7/8之间形成复合物，这些corepressors smxl6/7/8被泛素化和降级。strigolactone也破坏了D14受体的稳定性。当前模型提出D14通过SCF MAX2和蛋白酶体降解在SMXLS泛素化后发生D14降解。使用荧光和发光测定在表达与绿色荧光蛋白或荧光素酶的D14的转基因线上，我们表明，strigolactone诱导的D14降解也可能独立于SCF MAX2和/或SMXL6/7/8，通过蛋白酶体依赖性依赖性机制发生。此外，斯特龙酮水解对于触发D14或SMXL7降解不是必不可少的。还检查了突变体D14蛋白的活性，预测对斯特龙酮SIG nalling的功能是非功能的，并使用差异扫描荧光法研究了它们在体外结合Strigolactone的能力。最后，我们发现在某些条件下，D14降解的效率与SMXL7降解的效率不符。这些发现表明，与以前预期的有关D14降解的更复杂的调节机制，并提供了拟南芥信号传导动力学的新见解。
基因靶向聚合物theta缺乏拟南芥
tumefaciens介导的转化一直是生成转基因植物的首选工具。在此过程中，携带转基因的T-DNA从细菌转移到植物细胞，在该细菌中，它通过聚合酶theta（Pol H）介导的末端连接（TMEJ）随机地整合到基因组中。通过同源重组（HR）将T-DNA靶向特定的基因组基因座（HR），但这种基因靶向（GT）事件以低频发生，几乎总是伴随着随机整合事件。另一个复杂性是，T-DNA和目标基因座之间的重组的乘积不仅可以映射到目标基因座（TRUE GT），还可以映射到基因组中的随机位置（异位GT）。在这项研究中，我们通过使用用于Tebichi基因的Tebichi Gene突变的拟南芥，研究了TMEJ功能如何影响植物中GT的生物学，该基因编码为polH。虽然在TMEJ-Profientient植物中，我们主要发现GT事件伴随着随机T-DNA整合，而在TEB突变体背景中获得的GT事件缺乏其他T-DNA拷贝，从而证实了POL H在T-DNA整合中的基本作用。pol H的表现也阻止了异位GT事件，这表明导致此结果的事件顺序需要TMEJ。我们的发现提供了见解，可用于制定策略以获得农作物中的高质量GT事件。
使用crispr/ttlbcas12a用于planta基因靶向A. thaliana
CRISPR/CAS系统通过诱导特定位点DNA双链断裂（DSB）启用基因编辑。但是，诱导的修饰的性质高度取决于用于DNA DSB修复的机制。非同源末端连接（NHEJ）介导的靶向诱变是由CRISPR/CAS诱导的一种已经标准应用的工具，可以在特定的基因组位点导致各种不同种类的突变。尽管如此，使用同源供体序列的精确基因组修饰仍然具有挑战性。的应用取决于较不频繁的同源重组（HR）需要进一步改进，以创建一种有吸引力的植物应用工具。着眼于这个问题，我们开发了植物基因靶向（IPGT）系统，该系统基于同时切除稳定集成的同源供体序列和目标位点中DSB的诱导。近年来，增强了基因靶向（GT）频率的几种改进。在为IPGT链球菌CAS9（SP Cas9）和金黄色葡萄球菌Cas9（SA Cas9）成功地促进了，我们能够使用lachnospileceae cas12a（lb cas12a）进一步改善该系统，这也可以在T-rich区域进行切割。 最近，我们测试了IPGT的LB CAS12A（TT LB CAS12A）的改进，耐温度的版本，并能够进一步提高GT效率。 在这里，我们详细介绍了使用TT LB Cas12a详细介绍最近发布的IPGT系统的实验程序。 ©2020作者。，我们能够使用lachnospileceae cas12a（lb cas12a）进一步改善该系统，这也可以在T-rich区域进行切割。最近，我们测试了IPGT的LB CAS12A（TT LB CAS12A）的改进，耐温度的版本，并能够进一步提高GT效率。在这里，我们详细介绍了使用TT LB Cas12a详细介绍最近发布的IPGT系统的实验程序。©2020作者。
拟南芥抗病毒 RNA 干扰的正向和负向调节因子的鉴定
病毒-宿主共同进化常常会促使病毒逃逸免疫。然而，植物抗病毒的自然变异是否富含已知赋予植物必需抗病毒防御能力的 RNA 干扰 (RNAi) 途径基因仍不清楚。本文，我们报告了两项全基因组关联研究筛选，以探究野生采集的拟南芥种质对地方性黄瓜花叶病毒 (CMV) 的定量抗性的自然变异。我们证明，在两次筛选中与抗性显着相关的排名最高的基因可调控哥伦比亚-0 生态型中的抗病毒 RNAi。一个对应于减少休眠 5 (RDO5) 的基因通过促进病毒衍生的小干扰 RNA (vsiRNA) 的扩增来增强抗性。有趣的是，第二个基因被指定为抗病毒 RNAi 调节器 1 (VIR1)，它抑制抗病毒 RNAi，因此通过 CRISPR/Cas9 编辑使其基因失活可增强 vsiRNA 的产生和 CMV 抗性。我们的研究结果确定了抗病毒 RNAi 防御的正向和负向调节器，它们可能在病毒-宿主共同进化中发挥重要作用。