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ArciTect™ Cas9-eGFP 核酸酶
ArciTect™ Cas9-eGFP 核酸酶是一种融合蛋白，由增强型绿色荧光蛋白 (eGFP) 和来自化脓性链球菌的野生型 Cas9 重组蛋白组成；它包含一个 C 端连接的 eGFP 分子。ArciTect™ Cas9-eGFP 核酸酶需要与向导 RNA（例如 ArciTect™ sgRNA（目录号 #200-0013）或由 ArciTect™ tracrRNA（目录号 #76016）和 ArciTect™ crRNA（目录号 #76010）组成的双链）结合，以形成核糖核蛋白 (RNP) 复合物。该 RNP 复合物在基因组中的位点特定位置产生双链断裂。 ArciTect™ Cas9-eGFP 核酸酶还在 N 端含有核定位信号，确保 RNP 复合物转位至细胞核，从而提高基因组编辑的效率。由于 RNP 复合物在转染后完全发挥作用，因此在转位至细胞核后可立即发挥作用。RNP 复合物在 48 小时内降解，为基因组编辑提供了充足的时间，同时减少了 RNP 复合物持续存在可能导致的脱靶效应。使用 RNP 系统还可以避免生成稳定的 Cas9 表达细胞系的繁琐过程，从而节省时间并降低由于可诱导表达系统泄漏而导致脱靶效应的风险。化脓性链球菌 Cas9 使用原间隔区相邻基序 (PAM) 序列 NGG（其中 N 可以是任何核苷酸）。如果靶序列下游没有基因组 PAM 位点，酶就不会裂解。
细菌CRISPR/CAS9系统作为所有健康问题的有希望的解决方案，并进步的生物工程
缩写：BP1，肿瘤抑制剂p53结合蛋白1； BRCA，乳腺癌抗原；汽车，嵌合抗原受体； CAS9，CRISPR相关蛋白9;级联，抗病毒防御的CRISPR综合体； CMR，CAS模块坡道（重复相关的神秘蛋白质）； CMR III-B，多个亚基III型B CRISPR RNA-CAS蛋白； CPF1，Prevotella和Francisella1的CRISPR； CRISPR，定期间隔间隔室； Crrna，Crispr RNA； CSM III-A，多支亚基III-A CRISPR-CAS蛋白； dcas9/ sgrna-sg I，停用cas9/短指南RNA-Sybrr-green i; DNA-PK，DNA-蛋白K; DNA-PKC，DNA蛋白K催化亚基； DSB，双链断裂； ege，额外的基因元素； GRNA，导向RNA； HDR，同源性维修； IAP，碱性磷酸酶同工酶； MRE 11，减数分裂重组11; NHEJ，非同理结局加入； PAM，原始间隔者相邻基序； PD，程序性细胞死亡； RAD，重组酶A；代表，重复的外部回文； RPA，复制蛋白A； RT，逆转录酶； Sgrna，简短的指南RNA； SSB，单链断裂； tracrrna，反式激活CRISPR RNA； XLF，类似XRCC4的因子； XRCC 4，X射线修复交叉补充蛋白4； Yoyo-1，（恶唑黄色）
Alt-R™ HDR ENHANCER V2 提高效率... - NET
Alt-R HDR Enhancer V2 可提高脂质转染细胞的 HDR 效率。使用 0.75 μL Lipofectamine ® RNAiMAX ® 试剂（赛默飞世尔科技）将稳定表达 Cas9 的 HEK-293 细胞反向转染 gRNA 复合物（Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA 与 tracrRNA 复合），靶向人类基因组中的 SAA1、STAT3、SERPINC1 和 HPRT 38087（最终浓度 = 10 nM）和设计用于在 Cas9 裂解位点插入六个碱基的 Alt-R HDR 供体块（最终浓度 = 3 nM）。脂质转染后，立即将细胞培养在含有无处理（深蓝色）、DMSO（载体对照，浅蓝色）、30 μM Alt-R HDR 增强剂（深灰色）、0.5 μM Alt-R HDR 增强剂 V2（浅灰色）或 1 μM Alt-R HDR 增强剂 V2（绿色）的培养基中。24 小时后，移除旧培养基，并用不含 DMSO、Alt-R HDR 增强剂或 Alt-R HDR 增强剂 V2 的新鲜细胞培养基替换。脂质转染 48 小时后从每种样本类型中分离基因组 DNA，并通过 PCR 扩增目标编辑位点。使用 rhAmpSeq ™ CRISPR 分析系统对效率进行量化，该系统使用 NGS 分析来评估目标位置的 HDR 百分比。使用 rhAmpSeq CRISPR 分析工具分析了 NGS 读数。使用最终浓度为 1 μM 的 Alt-R HDR 增强剂 V2 实现了最高的 HDR。
CRISPR/Cas 技术及其在大肠杆菌中的应用
大肠杆菌是生产生物燃料和大宗化学品（如乙醇、高级醇、脂肪酸、氨基酸、莽草酸衍生物、萜类化合物、聚酮化合物和聚合物前体（如 1,4-丁二醇））的最广泛使用的细胞工厂之一（Yang 等人，2021 年）。生产这些生化物质的代谢工程需要对细胞代谢进行大量调节以提高生产率。基因组编辑需要高效的工具来执行节省时间的顺序或多重操作。大肠杆菌有许多基因编辑工具，但它们都有特定的优点和缺点。使用双链 DNA（dsDNA）进行基因工程重组通常需要选择标记，这些标记应在下一步中被消除，以便进行后续修改（Datsenko 和 Wanner，2000 年；Sharan 等人，2009 年）。与双链DNA相比，单链DNA（ssDNA）介导的重组效率更高，并已进一步发展为可进行多重编辑的基因编辑工具，如多重自动基因组工程（MAGE）（Wang et al.，2009）和可追踪多重重组（TRMR）（Warner et al.，2010）。但这些方法不适用于没有选择标记的20bp以上的多个靶基因插入，通常需要强大的高通量筛选方法（Li et al.，2015）。近来发展的成簇的规律间隔的短回文重复序列（CRISPR）/CRISPR相关蛋白（Cas）系统被广泛应用于大肠杆菌的基因工程，极大地促进了其应用。成熟的 CRISPR RNA (crRNA) 和反式激活 crRNA (tracrRNA) 双链（或单个合成向导 RNA，sgRNA）或仅 crRNA 引导 Cas 核酸酶切割具有所需原型间隔区相邻基序 (PAM) 的靶 DNA 序列 (Jiang et al., 2013)。我们之前的文章 (Liu et al., 2020) 总结了不同类型的 CRISPR 系统的机制。CRISPR/Cas 系统持续切割靶位点，直到成功编辑或未编辑的细胞死亡，从而无需使用选择标记。
使用 CRISPR-Cas9 作为限制性酶
图表列表 图 1.1：限制性酶的发现时间表及一般历史里程碑……………………………………………………………………………………………………… 2 图 1.2：中心法则图…………………………………………………………………… 4 图 1.3：不同类型的限制性酶；ZFN 和 TALEN 序列特异性分别与特定三联体或有限特定 bp 序列有关。粉红色高亮表示所示限制性酶或内切酶的结合位点。粗线表示切割位点………………………………………………………… 5 图 1.4：CRISPR-Cas9 系统的功能组件（Bortesi, L. 和 Fischer, R.，2014 年）。面板 (a) 显示了 Cas9 正常发挥功能所必需的各个 RNA 组件。图 (b) 显示 RNA 成分连接在一起形成 sgRNA 序列。……………………………………………………………………...… 8 图 3.1：设计引物的 Lambda DNA 凝胶电泳（目标大小 1000bp）。孔 1 显示大小标准（以“M 表示），孔 2 和 3 显示成功 PCR …………………………………………………………………………………..... 20 图 3.2：基于 Origene 的 CRISPR-Cas9 方案的凝胶电泳。含有梯状物的孔标记为“L”。含有未切割的 PCR 产物储备孔标记为“P”。标签 2/3、1X 和 4X 表示反应中使用的 DNA 浓度。标准浓度为 1X。孔 2-4、6-8、10-12、14-16、18 和 19 显示 CRISPR/Cas9 反应产物 .……………………………….…….….… 21 图 3.3：基于 Origene 的改良版 CRISPR-Cas9 方案的凝胶电泳图，其中模板 DNA 浓度和 Cas9 试剂浓度均增加。含有梯度的孔标记为“L”。含有未切割的 PCR 产物原料孔标记为“P”。孔 3-6、7、8、10-13、14 和 15 含有 CRISPR/Cas9 反应产物。所有反应均含有 10uL 模板 DNA .…………………………………………………..……………………..……...…. 22 图 3.4：基于 IDT 的改良版 CRISPR-Cas9 方案的凝胶电泳图。含有梯状物的孔标有“L”。含有未切割的 PCR 原液产物的孔标有“P”。孔 2 不含任何产物。孔 3-6、7-10 和 11-14 含有 CRISPR/Cas9 反应产物。所有反应均含有 tracrRNA。孔 11-14 含有 3 倍量（uL）的模板 DNA……… ...
基于 CRISPR-Cas9 的基因组工程...
（Doudna 和 Charpentier，2014 年）并在图 1a 中以示意图形式显示。许多细菌物种都有 CRISPR 和 Cas 基因座的变体，其中作为基因组编辑工具研究最广泛的变体是 CRISPR-Cas9 系统（Makarova 等人，2011 年）。CRISPR-Cas9 介导的基因组编辑需要一个 Cas9 引导 RNA（gRNA）复合物，其中包含 Cas9、CRISPR RNA（crRNA）和反式激活 CRISPR RNA（tracrRNA）（见框 1：CRISPR 术语）。如前所述，可以通过多种方法将该复合物引入靶细胞（Lino 等人，2018 年；Shi 等人，2021 年）。在 crRNA 的引导下，该复合物与补体 DNA 结合，并伴有侧翼的原始间隔区相邻基序 5 0 -NGG-3 0（对于化脓性链球菌 Cas9）（ Chylinski 等人，2013）。Cas9-gRNA 复合物在靶位点诱导双链断裂（ Deltcheva 等人，2011；Shah 等人，2013），靶细胞可以通过非同源末端连接 (NHEJ)（ Hefferin 和 Tomkinson，2005）或同源定向修复 (HDR)（ Liang 等人，1998）进行修复。在 NHEJ 中，断裂的 DNA 链被重新连接，可以直接重新连接，也可以在随机核苷酸插入或缺失后重新连接（ Takata 等人，1998）。这通常会导致移码突变和过早的终止密码子，因此，这种机制很容易用于敲除目的蛋白的表达。在 HDR 中，双链断裂是使用姐妹染色单体作为同源模板链来修复的。通过多次交换、DNA 合成和连接，受损链可以得到精确修复（Takata 等，1998）。不用姐妹染色单体作为模板链，而是将含有所需突变或基因盒的外源 DNA 模板以单链或双链 DNA 的形式引入，同源臂在外侧（Chen 等，2011；Radecke 等，2010；Rouet 等，1994）。多年来，越来越多的实验皮肤病学领域的研究利用了 CRISPR-Cas9 工具箱，尽管目前的数量有限，但在过去 5 年中有所增加（图 1 b 和 c 以及表 1）。本综述旨在认识到在人类表皮角质形成细胞 (KC) 中进行的所有 CRISPR-Cas9 工作，以确定在不同人类 KC 细胞来源中可用的最佳实践和成功策略的关键决定因素，同时为未来使用 CRISPR-Cas9 进行研究提供关键考虑，无论是基础应用还是临床应用。
基于CRISPR/Cas9 的激活系统研究进展
816–821。[11] Lowder L，Malzahn A，Qi YP. Rapid evolution of manifold CRISPR systems for plant gene editing. Front Plant Sci, 2016, 7: 1683。[12] Maeder ML，Linder SJ，Cascio VM，等。CRISPR RNA引导的内源性人类基因激活。Nat Methods, 2013, 10(10): 977-979。[13] Lindhout BI，Pinas JE，Hooykaas PJJ，等。利用锌指人工转录因子文库筛选拟南芥同源重组突变体。Plant J, 2006, 48(3): 475-483。[14] Liu WS，Rudis MR，Peng YH，等。合成TAL效应物用于靶向增强植物转基因表达。Plant Biotechnol J，2014，12(4):436-446。[15] Qi LS、Larson MH、Gilbert LA等。将CRISPR重新用作RNA引导平台，用于序列特异性控制基因表达。Cell，2013，152(5):1173-1183。[16] Chylinski K、Le Rhun A、Charpentier E。II型CRISPR-Cas免疫系统的tracrRNA和Cas9家族。RNA Biol，2013，10(5):726-737。[17] Nishimasu H、Cong L、Yan WX等。金黄色葡萄球菌Cas9的晶体结构。Cell，2015，162(5):1113-1126。 [18] Jinek M, Jiang FG, Taylor DW 等. Structures of Cas9 endonucleases reveal RNA-mediated configuration activity. Science, 2014, 343(6176): 1247997。[19] Anders C, Niewoehner O, Duerst A 等. Structural basis of PAM-dependent target DNA identification by the Cas9 endonuclease. Nature, 2014, 513(7519): 569-573。[20] Wang Y, Zhang ZT, Seo SO 等. Gene transcription repression in Clostridium beijerinckii using CRISPR-dCas9. Biotechnol Bioeng, 2016, 113(12): 2739-2743。[21] Bikard D, Jiang WY, Samai P 等.利用工程化的 CRISPR-Cas 系统可编程地抑制和激活细菌基因表达。Nucleic Acids Res，2013，41(15)：7429-7437。[22] Didovyk A、Borek B、Tsimring L 等人。利用 CRISPR-Cas9 进行转录调控：原理、进展和应用。Curr Opin Biotechnol，2016，40：177-184。[23] Li ZX、Xiong XY、Li JF。工作死物：将失活的 CRISPR 相关核酸酶重新用作植物中的可编程转录调节剂。aBIOTECH，2020，1(1)：32-40。[24] Piatek A、Ali Z、Baazim H 等人。RNA 引导的
基准
CRISPR/Cas9 系统天然存在于细菌和古细菌免疫系统中 [ 1 ] ；然而，它已被改造用于真核生物，成为获得诺贝尔奖的基因组编辑系统 [ 2,3 ] 。CRISPR/Cas9 系统使用 gRNA 将 Cas9 核酸酶引导至 NGG 原型间隔区相邻基序序列附近的特定靶标。然后，Cas9 切割 DNA，细胞的天然 DNA 损伤修复机制修复双链断裂。在 CRISPR/Cas9 编辑过程中，用于敲除和修饰靶基因的两种主要修复途径是非同源末端连接 (NHEJ) 和同源定向修复途径。当供体 DNA 模板不可用时，NHEJ 是修复双链断裂的主要选择，这使其成为 CRIPSR/Cas9 敲除实验的一个不错选择。核苷酸的丢失和获得是 NHEJ 介导的修复过程中的常见现象，而敲除则来自编码序列的移动。同源定向修复基于供体 DNA 模板的可用性，主要用于编码或非编码序列中的定制基因修饰 [4,5]。CRISPR/Cas9 系统越来越多地用于高级疗法，包括细胞和基因疗法，前景广阔（例如，用于治疗镰状细胞病的 CRISPR 测试）[6,7]。许多用于实现 CRISPR/Cas9 核酸酶 RNA 引导的基因组编辑的商业产品可通过多种递送方式获得。这些产品包括病毒、质粒、mRNA 和 RNP 中编码的 DNA。此外，CRISPR gRNA 可以分为两部分递送，即 crRNA 和 tracrRNA，或作为 sgRNA。多种细菌物种提供 CAS 蛋白选择；常用的一种是化脓性链球菌 Cas9。同样，这些分子进入细胞的方式也有很多，包括病毒载体（如慢病毒和腺相关病毒载体）和化学方法（如脂质、注射和电穿孔）[8,9]。尽管 CRISPR/Cas9 是一种令人兴奋的基因组编辑工具，但在使用 CRISPR/Cas9 编辑细胞后，关于基因组和表型稳定性的纵向数据有限。目前有几份报告提供的证据表明，CRISPR/Cas9 编辑还可能带来其他意想不到的长期变化[10–12]。此外，在选择编辑的细胞亚群时可能会出现遗传瓶颈。因此，对用于细胞和基因疗法等高级疗法的编辑细胞进行表征至关重要，因为这种疗法通常涉及给患者施用编辑过的细胞群[13]。
CRISPR-CAS9如何逐步工作
CRISPR-CAS9是编辑基因和基因组的强大工具。它使用引导的RNA在特定位置切割DNA，从而使研究人员可以操纵各种生物的基因组，包括动物，植物和微生物。基因编辑曾经被认为是科幻小说，但现在是现实。CRISPR-CAS9具有多种应用，包括创建遗传学的生物，治疗遗传疾病以及发展经济上重要的植物物种。有不同的方法来编辑基因，包括从生物体的基因组中插入，去除或删除序列。CRISPR-CAS9是为此目的最受欢迎的工具之一。它易于使用，高度准确且精确。该系统由核酸序列（CRISPR）和酶（CAS9）组成。需要一个引导的RNA（SGRNA）来促进目标特异性操作。CRISPR-CAS9系统于1987年首次由Ishino及其同事在1987年解释。在本文中，我们将使用简单的语言逐步解释该过程，以便初学者可以彻底理解它。我们不会从事科学写作，而要专注于外行术语的每个步骤。使用CRISPR-CAS9进行基因编辑的步骤是：1。选择实验2。选择目标基因位置3。选择并设计CRISPR-CAS9系统4。合成并克隆sgrna 5。交付sgrna和cas9 6。验证实验7。培养和分析替代细胞8。但是，其应用程序已扩展到各个字段。研究基因表达CRISPR系统首先用于研究基因敲除，其中从模型生物体中除去基因或DNA序列。通过遵循这些步骤，研究人员可以在实验室中执行基因编辑和基因工程。CRISPR-CAS9基因编辑：逐步指南我们将通过计算分析给定的基因，收集有关其序列，GC含量，表型和其他突变的数据。此信息将帮助我们设计带有指导的RNA来通过定位PAM序列来编辑基因。要选择一个用于沉默或去除的区域，我们必须选择适合我们实验要求的CRISPR-CAS9系统。提供不同的CAS蛋白，例如基因基因敲除，序列DCAS9的变化：激活和抑制以及其他诸如CAS13，Cas12，CSM，CMR和RNase III之类的其他。我们需要根据我们的需求选择正确的CAS9和CRISPR序列。CAS蛋白是一种可裂解单链和双链DNA的核酸酶。一个短的RNA序列（称为SGRNA或GRNA）可以通过靶向特定位置来编辑基因。sgrna有两个部分：具有互补的20个核苷酸的crRNA和识别Cas9的tracrocrrna环。一旦Tracrrna识别Cas，它就会将细胞核引导到裂口位置。，我们必须考虑到PAM序列的位置来计算设计SGRNA。一旦设计了GRNA，我们就需要将其合成并克隆质粒。我们的最先进的设施使我们能够在体外合成GRNA或SGRNA的寡聚。体外转录也有助于合成SGRNA。然后，我们选择一个特定的质粒，将GRNA基因插入其中，开发克隆，并分离从质粒表达的GRNA。现在我们的GRNA已合成，我们可以使用电穿孔方法将CAS9和SGRNA插入目标细胞中。我们还可以使用特定于CAS或病毒载体的mRNA，例如腺病毒，腺相关病毒，慢病毒和逆转录病毒。总体而言，CRISPR-CAS9基因编辑需要仔细的计划和执行。通过遵循这些步骤，我们可以使用这种强大的技术成功操纵基因。现在我们的CAS和SGRNA就在目标单元内，是时候验证敲除是否准确地发生了。用于验证的三种常见技术是聚合酶链反应（PCR），体外转录或DNA测序。DNA测序是在实验之前和之后进行的，使我们能够比较结果并确定是否已成功去除基因。PCR通过扩增从修饰细胞的目标序列来验证实验。此外，我们可以执行限制消化实验来验证结果。我们现在有了转基因细胞系，需要使用适当的培养基在无菌条件下培养它。一旦获得了足够量的细胞系，我们就可以将它们插入目标生物。注意：这是对CRISPR-CAS9机制的简化解释。Cas9核酸酶活性产生的差距不能保持未填充；取而代之的是，诸如非同源末端连接或直接DNA修复之类的DNA修复机制填补了空白。但是，我们的故事并没有结束。我们必须执行多个实验以检查改变的细胞的状态。基因表达研究是一种选择，我们在其中使用RT-PCR或定量PCR检查了所有细胞系改变基因的表达。可以在计算和物理上分析结果。计算工具有助于分析基因序列，表达谱等。体格检查有助于了解是否诱导了新的表型，是否仍然存在原始表型，或者结果不正确。此简短概述概述了在遗传实验室中进行CRISPR-CAS9实验的标准过程。但是，结果的特异性取决于我们选择的系统。如果我们选择了错误的CAS9，我们将无法实现所需的结果。SGRNA的设计也至关重要，因为如果不仔细设计，它可能会裂开未靶向区域。如果您有兴趣了解有关CRISPR-CAS9系统的更多信息，请从Addgene：CRISPR中阅读本文。与我们的新闻通讯一起呆在循环中，并包含最新的博客文章，发人深省的文章和重要的更新。另外，要第一个了解新产品和SNAG独家优惠！