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茄科作物病毒诱导基因组编辑方法的开发
使用 CRISPR/Cas 系统的基因组编辑 (GE) 彻底改变了植物诱变。然而，传统的转基因介导的 GE 方法存在局限性，因为通过组织培养生成表达 Cas9/单向导 RNA (sgRNA) 模块的稳定转基因系需要花费很长时间。病毒诱导的基因组编辑 (VIGE) 系统已成功用于模型植物，例如拟南芥和烟草属。在本研究中，我们开发了两种用于茄科植物的 VIGE 方法。首先，我们使用烟草脆裂病毒 (TRV) 载体将 sgRNA 递送到表达 Cas9 的转基因番茄 (Solanum lycopersicum) 品种 Micro-Tom 品系中。其次，我们设计了一种基于马铃薯病毒 X (PVX) 载体的非转基因 GE 方法来递送 Cas9 和 sgRNA。我们设计并克隆了靶向八氢番茄红素去饱和酶的 sgRNA，并将其放入 VIGE 载体中，并确定了 VIGE 的最佳条件。我们通过病毒载体接种后对靶基因的深度测序来评估 VIGE 效率，检测到 TRV 和 PVX 介导的 GE 的突变率分别为 40.3% 和 36.5%。为了提高编辑效率，我们采用了 37 ◦ C 热处理，这分别使 TRV 和 PVX 介导的 VIGE 的编辑效率提高了 33% 至 46% 和 56% 至 76%。为了获得编辑植物，我们对接种的子叶进行了组织培养，获得了成功的编辑事件。我们还证明 PVX 介导的 GE 可应用于其他茄科作物，例如马铃薯 (Solanum tuberosum) 和茄子 (Solanum melongena)。这些简单且高效的 VIGE 方法在茄科作物中生成基因组编辑植物方面具有巨大潜力。
胞嘧啶基础编辑器针对马铃薯原生质体中的基因组编辑进行了优化
在这项研究中，我们生成并比较了三个针对马铃薯（卵巢结核）制成的胞苷碱基编辑器（CBE），该量子量其最多赋予了原生质体池中所有等位基因的43％C-T转换。早些时候，基因编辑的马铃薯植物是通过聚乙烯二烯介导的CRISPR/CAS9转化原生质体的转化而成功产生的。在一项研究中，通过用内源性马铃薯ST U6启动子替换U6-1启动子的标准拟南芥，从而获得了3 - 4倍的编辑效率。在这里，我们使用了这种优化的构建体（SP Cas9/ st u6-1 :: grna1，Target GRNA序列GGTC 4 C 5 TTGGAGC 12 AAAAAC 17 TGG）用于生成CBES量身定制的马铃薯，并测试了用于C-T碱基编辑的CBES在Granule-Bounchase-bound starch synthase 1 Gene中的C-T碱基编辑。首先，将链球菌CAS9转化为（D10A）Nickase（NCAS9）。接下来，来自人hapobec3a（A3a），大鼠（EVO_RAPOBEC1）（RA1）或Sea Lamprey（EVO_ PM CDA1）（CDA1）的三种胞质脱氨酶之一（cda1）与NCAS9和A尿素 - DNA Glycosylase融合了C-Encas9（CDA1）与每种模块化的链接。CBE的总体高度有效，A3A具有最佳的总体基础编辑活动，平均为34.5％，34.5％和27％的C-T转换为C4，C5和C12，而CDA1的平均基础编辑活动的平均基础编辑活性为34.5％，34％，34.5％，14.25％C4和C4，C4和C4，C4和C4，C4和C4，C4。ra1在C4和C5时表现出平均基础编辑活性为18.75％，19％的基础编辑活动，是唯一在C12时显示C-TO-T转换的基本编辑器。
奥尔堡大学高效基因编辑策略......
马铃薯 ( Solanum tuberosum ) 是一种高度多样化的四倍体作物。优良品种杂合性极强，品种内和品种间短片段多态性 (indel) 和单核苷酸多态性 (SNP) 的发生率很高，在 CRISPR/Cas 基因编辑策略和设计中必须考虑这些因素才能获得成功的基因编辑。在本研究中，对马铃薯品种 Saturna 和 Wotan 中葡聚糖水双激酶 (GWD)1 和抗霜霉病 6 (DMR6-1) 基因分别进行深入测序，结果显示与杂合二倍体 RH 基因组序列相比，四倍体与二倍体相比，存在 indel 和 1.3 – 2.8 的高 SNP 发生率。这使向导 RNA (gRNA) 和诊断性 PCR 设计变得复杂。细胞库（原生质体）水平的高编辑效率对于实现四倍体中的完全等位基因敲除以及减少下游繁琐而精细的植株再生至关重要。在这里，CRISPR/Cas 核糖核蛋白颗粒 (RNP) 通过聚乙二醇 (PEG) 介导的转化瞬时递送到原生质体中。对于 GWD1 和 DMR6-1 中的每一个，设计了 6 – 10 个 gRNA 来靶向包含两个基因的 5 ' 和 3 ' 端的区域。与包括多种生物体的其他研究类似，单个 RNP/gRNA 的编辑效率差异很大，并且一些产生了特定的插入/缺失模式。尽管与靶向 3′ 端相比，靶向 GWD1 5′ 端的 RNP 产生的编辑效率明显更高，但 DMR6-1 5′ 端和 3′ 端的编辑效率似乎有些相似。当仅靶向 GWD1 基因的 3′ 端时，同时用两个 RNP 靶向 5′ 端或 3′ 端（多路复用）对总体编辑产生了明显的正协同效应。与单个 RNP/gRNA 转化中获得的编辑效率相比，位于不同染色体上的两个基因的多路复用对单个 RNP/gRNA 编辑效率没有影响或略有负面影响。这些初步发现可能会引发更大规模的研究，以促进和优化植物的精准育种。
寻求对面对环境缺氧的马铃薯软腐病疾病的抵抗力
摘要：植物暴露于包括病原体在内的各种压力源，需要特定的环境条件引起/诱导植物性疾病。这种现象称为“疾病三角”，直接与特定的植物病因相互作用有关。只有与易感植物品种相互作用的有毒病原体会在特定的环境条件下导致疾病。这似乎很难实现，但是软腐果杆菌科（SRP）是一组具有广泛宿主范围的致病细菌。此外，在农业中经常存在的问题（由此导致的缺氧）是这组病原体的青睐状况。供水本身是由于气体交换降低而引起的植物非生物应力的重要来源。因此，植物已经进化了一种基于乙烯的系统，用于低氧感测。植物反应通过荷尔蒙变化协调，这些变化诱导了对环境条件的代谢和生理调整。湿地物种，例如大米（Oryza sativa L.）和苦乐夜（Solanum dulcamara L.），已经开发了适应性，使它们能够承受较长的氧气可用性时期。马铃薯（茄索拉姆结核）虽然能够感知和对缺氧的反应，对这种环境压力很敏感。SRP利用了这种情况，该情况响应缺氧诱导毒力因子的产生，并使用环状二甘氨酸（C-DI-GMP）。为了实现该目标，我们可以寻找野土豆和其他茄种，以寻求抗水池的抗性机制。马铃薯块茎又减少了防御能力，以防止能量，以防止活性氧和酸化的负面影响，使它们容易发生软腐病疾病。为了减少由软腐病疾病引起的损失，我们需要敏感和可靠的方法来检测病原体，以隔离感染的植物材料。但是，由于SRP在环境中的高度流行，我们还需要创造出对疾病具有更具耐药性的新马铃薯品种。马铃薯耐药性也可以通过有益的微生物来帮助，这可以诱导植物的天然防御能力，但也可以浸水。然而，大多数已知的植物 - 借氧微生物患有缺氧，植物病原体可能胜过。因此，重要的是寻找可以承受缺氧或通过改善土壤结构来承受低氧或减轻其对植物的影响的微生物。因此，考虑到环境条件的影响，本综述旨在提出马铃薯对缺氧和SRP感染的反应以及预防软腐病疾病的未来前景的关键要素。
四倍体马铃薯中可以实现主要编辑，但需要改进
Anzalone AV、Randolph PB、Davis JR、Sousa AA、Koblan LW、Levy JM、Chen PJ、Wilson C、Newby GA、Raguram A 等人 (2019) 无需双链断裂或供体 DNA 的搜索和替换基因组编辑。Nature 576：149–157 Bastet A、Zafirov D、Giovinazzo N、Guyon-Debast A、Nogué F、Robaglia C、Gallois JL (2019) 通过 CRISPR-Cas9 碱基编辑模拟 eIF4E 中的天然多态性与对马铃薯病毒的抗性有关。Plant Biotechnol J 17：1736–1750 Butt H、Rao GS、Sedeek K、Aman R、Kamel R、Mahfouz M 通过水稻中的 prime 编辑实现除草剂抗性工程化。Plant Biotechnology Journal。 doi: 10.1111/pbi.13399 Fauser F, Schiml S, Puchta H (2014) 基于 CRISPR/Cas 的核酸酶和切口酶均可有效用于拟南芥的基因组工程。Plant J 79 : 348–359 Henikoff S, Comai L (2003) 植物功能基因组学的单核苷酸突变。Annual Review of Plant Biology 54 : 375–401 Hua K, Jiang Y, Tao X, Zhu JK 利用 prime editing 系统对水稻进行精准基因组工程。Plant Biotechnology Journal。doi: 10.1111/pbi.13395 Huang TK, Puchta H (2019) CRISPR/Cas 介导的植物基因打靶：同源重组终于迎来转机。 Plant Cell Rep 38 : 443–453 Li H, Li J, Chen J, Yan L, Xia L (2020) 通过 Prime Editing 对水稻外源和内源基因的精确修改。Molecular Plant 13 : 671–674 Lin Q, Zong Y, Xue C, Wang S, Jin S, Zhu Z, Wang Y, Anzalone AV, Raguram A, Doman JL 等人 (2020) 水稻和小麦的 Prime 基因组编辑。Nat Biotechnol 38 : 582–585 Mishra R, Joshi RK, Zhao K (2020) 作物中的碱基编辑：当前进展、局限性和未来影响。 Plant Biotechnol J 18 : 20–31 Sevestre F, Facon M, Wattebled F, Szydlowski N (2020) 促进马铃薯基因编辑：Solanum tuberosum L. cv. Desiree 基因组的单核苷酸多态性 (SNP) 图谱。Sci Rep 10 : 2045
红薯遗传和基因组研究助力可持续粮食和营养安全
粮食安全是发展中国家，特别是最不发达国家面临的主要挑战。在全球 78 亿人口中，约有 8.2 亿人遭受长期饥饿（www.un.org/，2020 年 6 月 9 日访问）。根据《2022 年全球粮食危机报告》（GRFC 2022），53 个国家/地区有 1.93 亿人生活在严重粮食不安全地区。尽管在一些发达国家，营养过剩而不是营养不足才是主要的公共卫生问题。然而，从全球角度来看，粮食不安全和营养不足是主要问题。此外，正在进行的 2019 年冠状病毒病 (COVID-19) 大流行和俄罗斯-乌克兰冲突将使这一数字进一步增加，因为发展中国家受到疾病、饥饿、供应链、经济后果以及农产品出口禁令的多重打击。过去几十年，大米、小麦和玉米这三种主要谷物占所有主食作物的 60%。然而，过度依赖少数作物品种会影响全球人口的粮食和营养安全，而作物生产多样化对于可持续的粮食系统至关重要。解决这些挑战的一个潜在方法是利用孤儿作物，它可以使作物生产多样化，提供更多的食物来源，并有助于遗传变异。孤儿作物也被称为未充分利用、丢失、次要或被忽视的作物，以及未来作物。一些孤儿作物的优势在于能够很好地适应当地和区域条件，即使在边缘地区和不利环境下，也需要较少的农业投入，并且可能受气候变化的影响较小。因此，孤儿作物对于保护农业生物多样性和农业生态系统非常重要，而这些对于粮食和农业生产的长期可持续性至关重要。红薯 [Ipomoea batatas (L.) Lam] 是旋花科（Convolvulaceae）的双子叶植物。继马铃薯（Solanum tuberosum L.）和木薯（Manihot esculenta Crantz）之后，红薯是世界第三大块根和块茎作物。传统上，红薯被视为“穷人的作物”，只有在饥荒或战争等紧急需要的时候才会吃，或是一种“孤儿作物”，与其他主要作物相比，它受到的关注有限。然而，在过去十年中，这种看法发生了变化，人们普遍承认红薯在缓解发展中国家的营养不良和饥饿方面具有巨大潜力。现在人们普遍认为，红薯是一种对营养和粮食安全很重要的作物，也是加工淀粉、生物乙醇和饲料用于各个领域的原料。重要的是，红薯具有比大多数主要粮食作物产生更多可食用能量的内在能力。如今，红薯被认为是一种营养价值很高的食物，因为其维生素A和C、β-胡萝卜素、花青素、钙和膳食纤维含量超过大多数其他主食。
马铃薯的 CRISPR/Cas 基因组编辑
马铃薯 ( Solanum tuberosum L.) (2 n = 4 x = 48) 是人类消费量继大米和小麦之后的第三大重要粮食作物。马铃薯被视为欧洲和美洲部分地区的主食。2018 年，世界马铃薯总产量为 3.6817 亿吨，其中中国（9026 万吨）位居第一，印度（4853 万吨）紧随其后（FAOSTAT，2018 年）。世界人口将从现在的 77 亿增加到预计 2050 年的 97 亿，对粮食供应构成了巨大挑战（联合国，2019 年）。马铃薯易受到各种病原体、害虫和环境非生物胁迫的侵害。在气候变化情景下，情况正在恶化。在印度，主要马铃薯种植邦的平均马铃薯产量（占全国马铃薯产量的 90%）可能会在 2050 年代下降 2.0%，在 2080 年代下降 6.4%（Rana 等人，2020 年）。为了解决这些问题，常规育种在品种开发计划中发挥了关键作用，同时结合标记辅助选择，主要针对晚疫病、病毒和马铃薯胞囊线虫 - 世界各地的抗性品种，例如印度的 Kufri Karan（ICAR-CPRI 年度报告，2018-19 年）。后来，马铃薯转基因技术也得到了开发，以抵抗疾病（如晚疫病和病毒）、非生物胁迫（如高温和干旱）、害虫（如马铃薯胞囊线虫和马铃薯块茎蛾）、加工品质（如降低冷诱导甜度），但它们均未在田间应用。因此，随着测序技术的进步和马铃薯基因组序列的可用性（马铃薯基因组测序联盟，2011），有可能应用基因组学工具（如基因组编辑）来调节目标基因。基因组编辑是一种先进的基因组学工具，可通过基因敲除和插入/缺失诱变来改良作物（Hameed 等人，2018）。它允许在基因组中的特定位点发生双链断裂（DSB），并通过自然发生的 DNA 修复机制进行修复，即非同源末端连接 (NHEJ) 或同源重组 (HR)。过去，该系统早期由蛋白质引导的核酸酶促进，例如锌指核酸酶 (ZFN) 和转录激活因子样效应核酸酶 (TALEN)。但现在，人们的注意力转向了一种新的 RNA 引导核酸酶，称为成簇的规律间隔的短回文重复序列 (CRISPR) — CRISPR 相关 (Cas) (Nadakuduti 等人，2018)。与组装 CRISPR/Cas 相比，TALEN 和 ZFN 需要特殊的专业知识、更长的时间和更高的成本。事实上，据报道，CRISPR/Cas 在作物中的应用取得了巨大进展。在马铃薯中，CRISPR/Cas 已被证明可以改善块茎品质、抗病性（晚疫病和马铃薯 Y 病毒）、表型和其他性状（Dangol 等人，2019 年；Hameed 等人，2020 年；Hofvander 等人，2021 年）。本文介绍了 CRISPR/Cas 的现状、未来前景以及马铃薯面临的挑战。
什么是有机食物定义
有机鱼土豆（结核茄）代表了有机食品运动的关键部分，该部分强调使用环保农业方法。有机农业避免了合成化学物质，例如人造农药和肥料，以及转基因的生物（GMO）。这种方法包括各种产品，从新鲜农产品到饼干，饮料和冷冻餐的加工食品。在过去的几十年中，对有机食品的需求已大大增长，将其转变为具有独特的生产，加工，分销和零售系统的数十亿美元行业。有机农业的特征是批准的方法，这些方法整合了旨在促进生态平衡，保护生物多样性和促进资源循环的文化，生物学和机械实践。这种方法拒绝合成肥料，污泥，辐照和基因工程，以及最终可能会出现在食物中的合成化学物质的残留物。“有机农业”一词据信是由牛津大学的农业学家诺斯伯恩（Lord Northbourne）起源于1940年。他建议将农场视为一种有机体，这一概念继续考虑到各种实践如何影响整个农场，这一概念继续坚持。尽管缺乏公认的有机食品或有机农业的定义，世界各地的政策和立法都在努力保护生物多样性，在农场上回收资源并促进生态平衡。是农场上不必要的游客，对农作物和牲畜造成了伤害。大多数国家都有自己的立法来定义有机农场允许的允许，而不是限制合成化学物质的限制。合成化学物质因其对环境，人类健康和粮食质量的潜在不利影响而受到有机农场的限制。在整个历史上，农民都使用化学特性来提高农作物的产量，但是过度使用导致空气和水污染，自然土壤生育能力降低，非靶向动物和植物的死亡以及食物中的潜在有害残留物。有机农业的一个主要目标是生产没有合成化学品及其残留物的食物，从而促进了更健康，更可持续的农业系统。有机农民不能使用合成农药，因此他们依靠预防措施，例如引入天然捕食者或使用植物性驱虫剂。生物防治涉及释放瓢虫，以控制害虫。一些有机农民还喜欢天然对害虫具有抗性的植物。尽管不使用合成农药，但有机农场仍可能在土壤中有残留的农业化学物质，这些农药可以通过水和空气等间接来源污染食物。然而，研究表明，与常规产品相比，有机食品中的农药残留较低。食品加工涉及化学物质，包装材料也会将不必要的物质浸入食物中。未经处理的有机食品在从农场到桌子的旅程中与其他化学物质接触的可能性较小。这些食物的生长和处理与常规食物的不同。好消息是，包括有机和非有机物在内的所有食物都必须遵守食品安全法规。这意味着您吃的任何食物都不应具有不可接受的化学污染物。有机食用食物可以帮助减少环境中的农业化学污染。有机食品必须符合特定的美国农业标准，以携带“有机”标签。生产有机食品的农民强调可再生资源并节省土壤和水。有机动物产品来自未给予抗生素或生长激素的动物。有机食品是不使用大多数常规农药，肥料，生物工程或电离辐射的。在可以将产品标记为“有机”之前，一位经过认证的检查员会检查农场是否符合USDA规则。处理有机食品的公司还必须获得认证。使用“天然”或“无农药”之类的术语并不意味着产品是有机的。有机食品必须至少有95％的有机食品才能携带标签。在营销产品时可以使用USDA密封件，但这不是强制性的。在美国，由于更严格的生产标准，水果和蔬菜占大多数有机食品的购买，这使得它们比非有机替代品更昂贵。