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RNA靶向和裂解 从造血干细胞到血小板
CRISPR-CAS是细菌和古细菌中使用CRISPR RNA引导的监视复合物的自适应免疫系统，以靶向互补的RNA或DNA，以破坏1-5。定期间隔的目标RNA裂解是III型效应子复合物6-8的特征。在这里，我们确定了synechocystis型III-DV复合物的结构，这是从多蛋白到单蛋白III型效应物9、10，在裂解前和裂解后状态下的明显进化中间体。结构显示了效应子中的多生成融合蛋白如何以不寻常的排列束缚在一起，以组装成活性和可编程的RNA核酸内切酶，以及效应子如何利用与其他III类型效应子的靶RNA播种的独特机制。使用结构，生化和量子/经典分子动力学模拟，我们研究了三个催化位点的结构和动力学，其中靶RNA上的核糖的2'-OH在上层磷酸盐的线体自我裂解中起着核噬菌的作用。引人注目的是，大多数III型复合物的催化转移的排列类似于核酶的活跃位点，包括锤头，手枪和Varkud卫星核酶。我们的工作提供了对III型效应型复合物进化中重要的中间体对RNA靶向和裂解机制的详细洞察力。
基于共编辑1策略2的T0代植物高效无转基因基因组编辑
对 T0 代植物进行无转基因基因组编辑是人们非常希望实现的目标，但同时也极具挑战性，尤其是在多年生植物和无性繁殖植物中。在这里，我们研究了通过农杆菌介导的胞嘧啶碱基编辑器 (CBE)/gRNA-Cas12a/crRNA-GFP 在植物体内瞬时表达来生成无转基因基因编辑植物的共编辑策略。具体而言，12 CBE/gRNA 用于碱基编辑 ALS 基因，从而赋予对除草剂氯磺隆的抗性，作为 13 选择标记，该抗性对植物表型没有负面影响；Cas12a/crRNA 用于编辑感兴趣的基因；GFP 用于选择无转基因转化子。使用 15 这种方法，可以在 T0 代中高效地针对番茄、烟草、马铃薯和柑橘中的各种基因 16 (单个或多个) 生成无转基因基因组编辑植物。除草剂抗性转化体中靶基因的双等位基因/纯合无转基因突变率在 8% 至 50% 之间。全基因组测序进一步证实了编辑植物中无转基因和无脱靶突变。共编辑策略对于在 T0 代中产生无转基因、基因组编辑植物是有效的，因此是植物遗传改良的有力工具。
17K17879研究结果报告
因此，我们旨在通过反复进行目标AID的基本构建以及对反馈的评估和验证，以建立高度的技术。 （1）基本技术的构建：首先创建超级目标AID，为了使基因组编辑更有效，我们将创建一个改进的功能目标AID（超级目标AID）。研究主要考虑质粒方面的变化。我们旨在通过使用没有复制能力的瞬态质粒来控制温度敏感启动子和组成启动子的DCAS9和CRISPR-GRNA，使用快速降解酶（LVATAG）[参考2]，以及使用抑制DNA修复机制（UGIS）的系统。接下来，我们还将考虑修改酶本身。我们还考虑使用反遗传方法的改进，例如减少CAS9非特异性结合的突变[参考3]，增加辅助酶活性的突变[参考4]以及对融合酶的接头长度的修改。 （2）评估基础替代效率：基因组编辑中靶点效应的验证，关键点是如何抑制与目标序列不同的位点的意外诱变，以及如何验证这一点。意外突变包括通过类似于目标序列的靶向序列引入的突变，以及完全独立于序列的非特异性突变。为了验证脱靶，使用破坏RPOB基因的利福平抗药性菌株进行评估。在改进目标基因，培养条件和目标AID的编辑方法的同时，进行了非目标评估，并最终进行了大肠杆菌的整个基因组序列以验证测试。
菊花 CRISPR/Cas9 基因编辑系统的建立
摘要 菊花是全球销量最高的四种切花之一。基因编辑是研究基因功能的重要工具，但目前尚无高效、精准的菊花基因组编辑工具。本研究建立了CRISPR/Cas9介导的基因编辑系统，以探索基因功能并提高菊花育种水平。我们利用Golden Gate Assembly系统构建了CRISPR/Cas9载体，用于双靶向Phytoene Dehydro（PDS）基因。为了测试sgRNA设计的准确性，我们最初使用了植物中的瞬时CRISPR/Cas9编辑（TCEP）方法。经瞬时转染的9株植物中靶基因表达量为正常水平的19.1%–52%，证实了靶基因敲除的可行性。我们进行了稳定转化；PCR 和靶位测序表明，获得的八株白化植物中有四株在靶位点进行了稳定编辑。我们通过靶向另一个基因 CmTGA1 进一步评估了该系统的编辑效率，之所以选择该基因，是因为它在菊花白锈病 (CWR) 疾病进展中具有潜在重要性。我们的数据表明，结合瞬时和稳定转化可提高基因组定点编辑的效率和成功率。我们在此建立的有效、可遗传的 CRISPR/Cas9 介导的基因组编辑系统为 C 的功能基因研究和遗传改良奠定了基础。菊花。
快速 CRISPR 竞争性检测，用于体外和体内发现影响造血系统的潜在药物靶点
CRISPR/Cas9 可用作实验工具来灭活细胞中的基因。然而，CRISPR 靶向细胞群不会显示靶基因的统一基因型。相反，会产生多种基因型 - 从野生型到不同形式的插入和缺失。这种混合基因型使对所研究细胞群中靶基因作用的分析变得复杂。在这里，我们提出了一种快速通用的实验方法来功能性分析 CRISPR 靶向细胞群，而无需生成克隆系。作为简单的读数，我们利用 CRISPR 诱导的遗传异质性并使用测序来确定不同基因型相对于所研究的细胞行为或表型是如何富集或消耗的。该方法使用标准 PCR、Sanger 测序和简单的序列反卷积软件，使没有特定深入经验的实验室也能进行这些实验。作为原理证明，我们提供了研究造血细胞各个方面的例子（体内 T 细胞发育和体外活化、巨噬细胞和树突状细胞分化以及原癌基因过度表达诱导的白血病样表型）。总之，我们提出了一种快速的实验方法来识别与成熟免疫细胞以及正常和恶性造血相关的潜在药物靶点。2021 作者。由 Elsevier BV 代表计算和结构生物技术研究网络出版。这是一篇根据 CC BY-NC-ND 许可开放获取的文章（http://creative-commons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）。
具有肿瘤选择性的T细胞与双特异性抗体...
摘要使用T细胞探手（TCE）来治疗实体瘤是有挑战性的，并且由于较大的靶向上，肿瘤的毒性较低，由于健康组织中靶抗原的低水平抗原表达，因此有狭窄的治疗窗口受到限制。在这里，我们描述了TNB-928B，这是一种完全人类的TCE，它具有叶酸受体α（FRα）的二价结合臂，以选择性地靶向FRα过表达的肿瘤细胞，同时避免了FRα表达较低的细胞的裂解。FRα结合臂的二价设计赋予肿瘤选择性，这是由于低亲和力但与高FRα抗原密度细胞的高持续结合。TNB-928B在高FRα表达细胞上诱导优先效应T细胞激活，增殖和选择性细胞毒性活性，同时保留低FRα表达细胞。另外，与含有OKT3的阳性对照TCE相比，TNB-928B诱导最小的细胞因子释放。此外，TNB-928B使用内源性T细胞和体内稳健的肿瘤清除表现出大量的离体肿瘤细胞裂解，在卵巢癌小鼠模型中促进了T细胞浸润和抗肿瘤活性。TNB-928B表现出类似于常规抗体的药代动力学，预计可以在人类中有利地给药。TNB-928B是一种新型TCE，具有增强的安全性和特异性，可治疗卵巢癌。TNB-928B是一种新型TCE，具有增强的安全性和特异性，可治疗卵巢癌。
PHF5A有助于维持癌症茎...
摘要。目标。癌症干细胞（CSLC）与肿瘤复发，转移和耐药性密切相关。PHD指域蛋白5A（PHF5A）与非小细胞肺癌（NSCLC）的肿瘤发生和发展有关。PHF5A在NSCLC CSLC中的作用和调节机制尚不清楚。这项研究旨在确定CSLC的生物学特征以及PHF5A在维持NSCLC中的作用。方法。H1299-SPHERES和A549-SPHERE通过流式细胞仪通过肿瘤组形成测定和CSLC获得。使用免疫荧光染色，qRT-PCR和Western印刷物测试了CD133，E-钙粘蛋白1，E-钙粘蛋白，波形蛋白，PHF5A和组蛋白脱乙酰基酶8（HDAC8）的表达。CCK-8和Transwell分析来确定NSCLC中CSLC和粘附单层细胞的增殖，迁移和侵袭能力。我们调节CSLC中的PHF5A表达和HDAC活性，以探索NSCLC组织中靶蛋白的PHF5A在Stemness维持中的机理。结果。与单层细胞相比，CSLCs对顺铂介导的抑制，迁移和侵袭的抑制作用以及pHF5A和HDAC8的高表达降低，并伴有EMT标记的改变。NSCLC CSLC中PHF5A的靶向敲低导致茎表型和HDAC8表达降低，而HDAC活性的抑制会影响Stemness的维持。此外，靶蛋白的表达在NSCLC组织中显示出一致的变化。结论。与单层细胞相比，NSCLC的癌症样表型特性发生了变化，PHF5A参与了CSLC的干性维持，并且此过程可能与HDAC8的激活有关。
使用息肉素反向Hoogsteen发夹技术对点突变的基因校正
单基因疾病通常是特定基因单点突变的结果，导致非功能蛋白的产生。不同的血液疾病，例如β-丘脑贫血，镰状细胞病，遗传性球细胞增多症，fanconi贫血和血友病A和B，通常是由点突变引起的。基因编辑工具，包括Talens，ZFN或CRISPR/CAS平台，以纠正负责不同疾病的突变。然而，不依赖核酸酶活性的替代分子工具，例如形成三核苷酸及其衍生物（例如肽核酸），也证明了它们在DNA中纠正突变的能力。在这里，我们回顾了修复 - 螺肽反向Hoogsteen发夹（PPRHS）技术，该发夹可以代表该领域内的替代基因编辑工具。修复-PPRHS是由由五甲状腺素桥连接的两个息肉素镜重复序列形成的单链DNA分子，然后在分子的一端进行扩展序列，该序列是与DNA序列同源的，但要修复了DNA序列，但含有修复的DNA序列。PPRH的两个息肉臂由嘌呤之间的分子内反间隔键结合，从而形成了发夹结构。该发夹芯与watson-crick键以序列特异性方式与dsDNA中靶突变相对近乎近距离突变结合，从而产生了刺激重组的三重结构。这项技术已成功地用于修复其内源性基因座中DHFR和APRT基因突变体在哺乳动物细胞中的集合，并且可以适合校正负责血液疾病的突变。
与 CAF 抑制剂的协同治疗组合可通过减少 CAF 释放的 IL-6 增强 CAR-NK 介导的细胞毒性
摘要 背景 肿瘤微环境 (TME) 中的癌相关成纤维细胞 (CAF) 导致自然杀伤 (NK) 细胞功能受损，而自然杀伤 (NK) 细胞已成为一种有前途的治疗方式。TME 内的 CAF 和 NK 细胞之间的相互作用对免疫反应具有主要的抑制作用，表明 CAF 靶向疗法是有效 NK 介导的癌症杀伤的潜在靶点。 方法 为了克服 CAF 诱导的 NK 功能障碍，我们选择了抗纤维化药物尼达尼布进行协同治疗。为了评估协同治疗效果，我们建立了体外 3D Capan2/患者来源的 CAF 球体模型或体内混合 Capan2/CAF 肿瘤异种移植模型。通过体外实验揭示了 NK 介导的与尼达尼布协同治疗联合的分子机制。随后评估了体内治疗组合功效。此外，通过免疫组织化学方法测量患者来源的肿瘤切片中靶蛋白的表达评分。结果尼达尼布阻断了血小板衍生的生长因子受体 β (PDGFR β ) 信号通路并减少了 CAF 的激活和生长，从而显著降低了 CAF 分泌的 IL-6。此外，在 CAF/肿瘤球体或异种移植模型中，尼达尼布的联合给药提高了间皮素 (MSLN) 靶向嵌合抗原受体-NK 介导的肿瘤杀伤能力。协同组合导致体内强烈的 NK 浸润。尼达尼布单独使用没有效果，而阻断 IL-6 反式信号传导可改善 NK 细胞的功能。MSLN 表达和 PDGFR β + -CAF 群体面积（潜在的预后/治疗标志物）的组合与较差的临床结果相关。结论我们针对含有 PDGFR β + -CAF 的胰腺癌的策略可以改善胰腺导管腺癌的治疗。
比较三种不同递送方法在菊苣中实现 CRISPR/Cas9 介导的基因组编辑。
菊苣根 ( Cichorium intybus L. var. sativum ) 用于提取菊粉，菊粉是一种用作天然甜味剂和益生元的果糖聚合物。然而，在菊粉提取过程中需要去除味道苦涩的倍半萜内酯，而菊苣正是因为这种内酯才具有其独特的风味。为了避免这种提取过程及其相关成本，最近通过灭活四个拷贝的 germacrene A 合酶基因 ( CiGAS-S1、-S2、-S3、-L )，创建了倍半萜内酯含量较低的菊苣变种，该基因编码的酶可启动菊苣中苦味倍半萜内酯的生物合成。在本研究中，对 CRISPR/Cas9 试剂的不同递送方法进行了比较，比较了它们在 CiGAS 基因中诱导突变的效率、脱靶突变的频率以及它们对环境和经济的影响。 CRISPR/Cas9 试剂通过农杆菌介导的稳定转化或使用相同 sgRNA 的质粒或预组装核糖核酸复合物 (RNP) 瞬时递送。所有使用的方法都会导致 CiGAS -S1 和 CiGAS -S2 基因中出现大量 INDEL 突变，这些基因与所用的 sgRNA 完全匹配；此外，与 sgRNA 有一个错配的 CiGAS -S3 和 CiGAS -L 基因也发生了突变，但突变效率较低。虽然使用 RNP 和质粒递送会导致双等位基因、杂合或纯合突变，但质粒递送会导致 30% 的质粒片段在基因组中不必要地整合。通过农杆菌转化的植物通常表现出嵌合现象和 CiGAS 基因型的混合。当植物生长较长时间时，这种基因镶嵌变得更加多样化。虽然瞬时和稳定递送方法中靶基因型各不相同，但在六种已识别的潜在脱靶中未发现脱靶活性，这些脱靶存在两到四个错配。这些方法对环境的影响（温室气体 (GHG) 排放和一次能源需求）在很大程度上取决于它们各自的电力需求。从经济角度来看 - 就像大多数研究和开发一样