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World File Search System共转染
在乳腺癌细胞中雌激素受体靶向疗法中miR-33a表达的体外研究 供应链协作对... 的调节作用 长大后应该是什么？ Lewis Mattin博士讲师... jsdewes-基于自然通风的夏季峰值条件下预测热舒适度的计算方法 印度尼西亚的能源转变：依赖性，补贴和可再生能源
摘要：（1）背景：脂肪酸合成的增加导致乳腺癌的侵略性表型和使治疗剂的效率。在脂质生物合成途径上作为miR-33a的调节microRNA（miRNA）具有阐明确切机制的潜力。（2）方法：我们确定了MCF-7和MDA-MB-231乳腺癌细胞暴露于雌激素受体（ER）激活剂（Estradiol-17β，E2）或抗雌激素（ICI 182,780，在非cy毒性浓度下）的miR-33a表达水平。我们通过免疫印迹将细胞中的miR-33a表达水平与与细胞脂质生物合成相关的途径相关。（3）结果：miR-33a模拟治疗导致MCF-7细胞中脂肪酸合酶（FASN）的显着下调，而在MDA-MB-231细胞中则没有在雌激素-17β（E2）或Fulvesterant（Fulvertant（Ful）的情况下）。与miR-33a抑制剂效应相反，miR-33a与E2或FUL的MIMIC共转染导致MCF-7细胞中AMP激活的蛋白激酶α（AMPKα）活性减少。E2不管miR-33a细胞水平如何，MDA-MB-231细胞中的FASN水平都会增加。 miR-33a抑制剂共处理抑制了MDA-MB-231细胞中E2介导的AMPKα活性。 （4）结论：miR-33a的细胞表达水平对于理解包括细胞能量传感器（例如AMPKα激活状态）的差异反应至关重要。E2不管miR-33a细胞水平如何，MDA-MB-231细胞中的FASN水平都会增加。miR-33a抑制剂共处理抑制了MDA-MB-231细胞中E2介导的AMPKα活性。（4）结论：miR-33a的细胞表达水平对于理解包括细胞能量传感器（例如AMPKα激活状态）的差异反应至关重要。
PDE4D 细胞活性检测试剂盒
目录 #60505 描述 磷酸二酯酶 (PDE) 在 cAMP 和 cGMP 信号的动态调节中起着重要作用。PDE4D 具有 3',5'-环-AMP 磷酸二酯酶活性并降解 cAMP。PDE4D 抑制剂抑制其活性会导致细胞内 cAMP 水平升高。PDE4D 基因编码至少 9 种不同的异构体，与中风、哮喘、心律失常和心肌病有关，使其成为重要的治疗靶点。PDE4D 细胞活性检测旨在筛选培养细胞中的 PDE4D7 抑制剂。该检测基于用 CRE 荧光素酶报告基因转染细胞。CRE 报告基因包含受 cAMP 反应元件 (CRE) 控制的萤火虫荧光素酶基因。细胞内 cAMP 升高会激活 CRE 结合蛋白 (CREB) 以结合 CRE 并诱导荧光素酶的表达。福斯高林常用于提高细胞生理学研究中的细胞内 cAMP 水平。当用 CRE 报告基因瞬时转染的细胞被福斯高林激活时，细胞内 cAMP 水平上调，从而诱导 CRE 荧光素酶报告基因的表达。然而，当细胞用 PDE4D7 表达载体和 CRE 报告基因共转染时，福斯高林诱导的 cAMP 水平降低，导致荧光素酶表达水平降低。当用 PDE4D 抑制剂处理细胞以抑制 PDE4D7 活性时，cAMP 水平恢复，导致荧光素酶活性更高。该试剂盒包括 CRE 荧光素酶报告基因（预混有组成性表达的 Renilla（海三色堇）荧光素酶载体，作为转染效率的内部对照）、PDE4D7 表达载体和福斯高林。应用
干细胞研究-Chen Lab-休斯顿大学
分子超分辨率显微镜（Chen等，2015），Geneti Cally用SNAP-TAG（一种突变的人O 6-烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶）标记了SOD1，可以用各种合成探测器将其共价标记（Keppler et al。通过两轮CRISPR-CAS9介导的同源性建议，获得了遗传修饰的H1 HESC纯合子克隆（H1_SOD1-SNAP）。在三氨基 - 酸 - 酸 - 链接中，将SNAP基因插入了SOD1编码区的C末端（图1 a）。H1 HESC与单个诱导RNA（SGRNA）-CAS9 PLAS MIDS和含有质粒的重组供体共转染。挑选了在分裂克隆中出现的并进行筛选以进行快照插入。首先获得了由一个快照敲入等位基因组成的杂合子克隆，并进行了第二轮CRISPR-CAS9诱导的SNAP敲击。然后，我们成功地产生了通过基因分型PCR，Sanger测序和Southern blot分析确认的纯合子快照敲入克隆（图1 B，补充。 图 1和补充。 图 2）。 通过使用抗SNAP和抗SOD1抗体进行免疫印迹证实了SOD1-SNAP融合蛋白在敲门细胞裂解物中的表达（图1 B，补充。图1和补充。图2）。通过使用抗SNAP和抗SOD1抗体进行免疫印迹证实了SOD1-SNAP融合蛋白在敲门细胞裂解物中的表达（图1 F和补充。图4）。大多数SOD1-SNAP蛋白在敲击细胞裂解物中保持完整，仅几乎无法检测到的未标记的SOD1信号水平，这可能源自裂解（图1 f）。与H1亲本细胞中的内源SOD1水平相比，总体SOD1-SNAP蛋白水平降低了，这表明TAG
使用整合和抗 CRISPR (IntAC) 在果蝇细胞中进行更高分辨率的全基因组 CRISPR 敲除筛选
2 霍华德休斯医学研究所，波士顿，MA 02115 通信：ram@genetics.med.harvard.edu (RV)；perrimon@genetics.med.harvard.edu (NP) 摘要 CRISPR 筛选可实现系统的、可扩展的基因型到表型映射。我们之前开发了一种用于果蝇和蚊子细胞系的汇集 CRISPR 筛选方法，使用质粒转染和位点特异性整合来引入单向导 (sgRNA) 文库，然后进行 PCR 和整合的 sgRNA 测序。虽然有效，但该方法依赖于早期组成型 Cas9 活性，这可能会导致基因组编辑和 PCR 检测到的 sgRNA 之间存在差异，从而降低筛选准确性。为了解决这个问题，我们引入了一种新方法来共转染表达抗 CRISPR 蛋白 AcrIIa4 的质粒以抑制早期 sgRNA 表达期间的 Cas9 活性，我们称之为“IntAC”（与抗 CRISPR 整合酶）。 IntAC 使我们能够构建一种由高强度 dU6:3 启动子驱动的新型 CRISPR 筛选方法。这个新库显著提高了整个基因组中适应性基因的精确度，在 5% 的误差范围内检索了 90-95% 的必需基因组，使我们能够生成迄今为止为果蝇组装的最全面的细胞适应性基因列表。我们的分析确定，IntAC 方法允许的升高的 sgRNA 水平推动了大部分改进。果蝇适应性基因与人类适应性基因表现出很强的相关性，并强调了旁系同源物对基因必需性的影响。我们进一步证明，IntAC 与靶向 sgRNA 子库相结合，能够在溶质超载下精确地正向选择转运蛋白。IntAC 是对现有果蝇 CRISPR 筛选方法的直接增强，显著提高了准确性，并且可能广泛应用于其他细胞类型（包括蚊子、鳞翅目、蜱虫和哺乳动物细胞）中的无病毒 CRISPR 筛选。
Cas9 介导的 β-catenin 突变校正和...
目的：结直肠癌 (CRC) 是导致癌症死亡和发病率的主要原因之一。迫切需要找到对抗 CRC 的策略。APC 或 β -catenin 的驱动基因突变在 CRC 的发生和进展中起重要作用。在本研究中，我们联合应用 CRISPR/Cas9-sgRNA 系统和单链寡脱氧核苷酸 (ssODN) 作为模板来纠正结肠癌细胞系 HCT-116 中存在的 β -catenin 的杂合 Δ TCT 缺失突变。该方法为癌症的基因治疗提供了一种潜在的策略。方法：构建 Cas9/β -catenin-sgRNA-eGFP 共表达载体并与 ssODN 共转染到 HCT-116 细胞中。通过 FACS 分选突变校正的单细胞克隆，并通过 TA 克隆和 DNA 测序进行判断。通过实时定量PCR、Western印迹、CCK8、EDU染色和细胞接种克隆检测CRISPR/Cas9介导的校正效果。此外，还分析了裸鼠异种移植瘤中细胞克隆衍生肿瘤的生长情况。结果：CRISPR/Cas9介导的β-catenin突变校正导致TCT序列的存在和Ser45处磷酸化β-catenin的重新表达，从而恢复了磷酸化β-catenin的正常功能，包括减少核β-catenin的运输和下游c-myc、survivin的表达。在β-catenin突变校正的细胞中观察到细胞生长显著减少。移植了突变校正的HCT-116细胞的小鼠的肿瘤大小明显小于未校正的异种移植瘤。结论：本研究数据表明，通过 CRISPR/Cas9 和 ssODN 的组合来纠正驱动突变可以极大地改善癌细胞系的生物学行为，表明该策略在癌症基因治疗中具有潜在的应用价值。关键词：CRISPR/Cas9、ssODN、靶向基因编辑、β-catenin、结肠癌
一个用于体外心脏电生理学的可访问平台
图1。点击编辑的概述和开发。a，单击编辑器的示意图（CE），它是由RNA程序编程的DNA nickase，DNA依赖性DNA聚合酶和ssDNA绑扎域组成的融合蛋白（例如，嗯，核酸内切酶； Huhe）与导向RNA（GRNA）配对。Click-DNA（clkDNA）模板是一种单链DNA寡核苷酸，它编码底漆结合位点（PBS），聚合酶模板（PT）和Huhe识别位点B，从709序列产生的系统生成树47序列47，描绘了Huains多样性的小型元素，该序列是47个序列。量表表示序列之间的分数相关性。c，与ssDNA分子共价磷酸酪氨酸加合物形成共价磷酸酪氨酸加合物的示意图，其中huhe结合了识别顺序以引发单点样共轭反应。d，逐步点击编辑机制，涉及：（1）DNA目标位点释放非目标链（NTS）3'基因组瓣，（2）NTS laps plap杂交与clkDNA PBS，（3）NTS-NTS-NTS-NTS-PBS连接与DNA依赖性DNA Polimentsion（4）nts-pbs intthers（3） clkDNA的编码PT，（5）新合成的3'和天然基因组5'襟翼之间的平衡，以及（6）5'-flap裂解，导致编辑结合。e，在HEK 293T细胞中的点击编辑转染的示意图，涉及CE质粒的共转染（Porcine Circovirus 2（PCV2）Huhe Huhe与NSPCAS9（H840A）融合，并从e.coli dna Polymerase I（DNA Polymerase I（DNA Polymerase I（DNA Polymerase I（DNA Polymerase I（DNA））中， clkDNA和一个（或两个）GRNA质粒（S）。ngrna）针对非编辑链的目标编辑效率。f，g，使用DNMT1 GRNA和带有PBS13-PT12的clkDNA插入或读取突变（Indels）的 f，g， f，g， f，g， f，g， f，g， f，g，使用PBS13-PT12编码A +3- 5 cag deletion（使用A +49 nick; Panel f）或rnf2 grna a +rnf2 grna a +rnf2 grna a +rnf2 gkdna A +3-5 clkDNA A +49-PT12替换（带有+5“ 2b”刻度；面板G）。 CE1，CE（PCV2-NSPCAS9（H840A）-ECKLENOW），带有一个GRNA，以指导非目标链刻度； CE1.N2，CE1带有额外的grna来指导刻痕（即f，g， f，g， f，g， f，g， f，g， f，g，使用PBS13-PT12编码A +3- 5 cag deletion（使用A +49 nick; Panel f）或rnf2 grna a +rnf2 grna a +rnf2 grna a +rnf2 gkdna A +3-5 clkDNA A +49-PT12替换（带有+5“ 2b”刻度；面板G）。 CE1，CE（PCV2-NSPCAS9（H840A）-ECKLENOW），带有一个GRNA，以指导非目标链刻度； CE1.N2，CE1带有额外的grna来指导刻痕（即f，g， f，g， f，g， f，g， f，g，使用PBS13-PT12编码A +3- 5 cag deletion（使用A +49 nick; Panel f）或rnf2 grna a +rnf2 grna a +rnf2 grna a +rnf2 gkdna A +3-5 clkDNA A +49-PT12替换（带有+5“ 2b”刻度；面板G）。 CE1，CE（PCV2-NSPCAS9（H840A）-ECKLENOW），带有一个GRNA，以指导非目标链刻度； CE1.N2，CE1带有额外的grna来指导刻痕（即f，g， f，g， f，g， f，g，使用PBS13-PT12编码A +3- 5 cag deletion（使用A +49 nick; Panel f）或rnf2 grna a +rnf2 grna a +rnf2 grna a +rnf2 gkdna A +3-5 clkDNA A +49-PT12替换（带有+5“ 2b”刻度；面板G）。 CE1，CE（PCV2-NSPCAS9（H840A）-ECKLENOW），带有一个GRNA，以指导非目标链刻度； CE1.N2，CE1带有额外的grna来指导刻痕（即f，g， f，g， f，g，使用PBS13-PT12编码A +3- 5 cag deletion（使用A +49 nick; Panel f）或rnf2 grna a +rnf2 grna a +rnf2 grna a +rnf2 gkdna A +3-5 clkDNA A +49-PT12替换（带有+5“ 2b”刻度；面板G）。 CE1，CE（PCV2-NSPCAS9（H840A）-ECKLENOW），带有一个GRNA，以指导非目标链刻度； CE1.N2，CE1带有额外的grna来指导刻痕（即f，g， f，g，使用PBS13-PT12编码A +3- 5 cag deletion（使用A +49 nick; Panel f）或rnf2 grna a +rnf2 grna a +rnf2 grna a +rnf2 gkdna A +3-5 clkDNA A +49-PT12替换（带有+5“ 2b”刻度；面板G）。 CE1，CE（PCV2-NSPCAS9（H840A）-ECKLENOW），带有一个GRNA，以指导非目标链刻度； CE1.N2，CE1带有额外的grna来指导刻痕（即f，g，使用PBS13-PT12编码A +3- 5 cag deletion（使用A +49 nick; Panel f）或rnf2 grna a +rnf2 grna a +rnf2 grna a +rnf2 gkdna A +3-5 clkDNA A +49-PT12替换（带有+5“ 2b”刻度；面板G）。CE1，CE（PCV2-NSPCAS9（H840A）-ECKLENOW），带有一个GRNA，以指导非目标链刻度； CE1.N2，CE1带有额外的grna来指导刻痕（即