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查尔酮将 cTXNPx 鉴定为潜在的抗利什曼病药物靶点
目前的药物治疗由于毒性、低疗效和耐药性而失败；利什曼病是全球面临的重大健康挑战，迫切需要新的经过验证的药物靶点。受天然查尔酮 2',6'-二羟基-4'-甲氧基查尔酮 (DMC) 活性的启发，硝基类似物 3-硝基-2',4',6'-三甲氧基查尔酮 (NAT22, 1c) 被确定为强效的广谱抗利什曼原虫药物先导。结构修饰提供了一种含炔烃的化学探针，该探针标记了寄生虫内的一种蛋白质，该蛋白质被证实为胞浆锥虫过氧化物酶 (cTXNPx)。至关重要的是，在前鞭毛体和巨噬细胞内无鞭毛体生命形式中都观察到了标记，没有证据表明宿主巨噬细胞具有毒性。查尔酮在寄生虫中孵育会导致 ROS 积累和寄生虫死亡。通过 CRISPR-Cas9 删除 cTXNPx 会显著影响寄生虫表型，并降低查尔酮类似物的抗利什曼原虫活性。与计算机模拟 cTXNPx 同源性模型的分子对接研究表明，查尔酮能够结合假定的活性位点，阻碍其接近关键的半胱氨酸残基。总之，这项研究将 cTXNPx 确定为抗利什曼原虫查尔酮的重要靶点。
稳定表达 Cas9 和 T7 RNA 聚合酶的利什曼原虫 (Viannia) braziliensis 的有效基因组编辑
直到 2015 年，阐明利什曼原虫蛋白质功能的功能丧失研究都依赖于通过同源重组进行基因破坏。随后，CRISPR/Cas9 革命影响到了这些原生动物寄生虫，只需一轮转染即可实现有效的基因组编辑。此外，LeishGEdit 的开发（一种基于 PCR 的工具包，用于使用 CRISPR/Cas9 生成敲除和标记系）使基因组编辑更加直接有效。在此系统中，质粒 pTB007 被递送至利什曼原虫，在 b-微管蛋白基因座中进行游离表达或整合，并稳定表达 T7 RNA 聚合酶和 Cas9。在南美洲，尤其是在巴西，利什曼原虫 (Viannia) braziliensis 是皮肤利什曼病最常见的病原体。与利什曼原虫相比，L. braziliensis b-微管蛋白基因座表现出显著的序列差异，这阻碍了 pTB007 的有效整合和 Cas9 的稳定表达。为了克服这一限制，pTB007 中存在的 L. major b-微管蛋白序列被利什曼原虫 (Viannia) b-微管蛋白保守序列取代，从而产生了 pTB007_Viannia 质粒。这一修改使 pTB007_Viannia 盒式磁带成功整合到 L. braziliensis M2903 基因组中，并且计算机预测表明这也可以在其他 Viannia 物种中实现。通过敲除鞭毛蛋白 PF16 来评估 Cas9 的活性，这导致这些转染子中出现不动表型。内源性PF16也成功被mNeonGreen标记，并采用基因座互补策略将PF16基因的C端标记拷贝返回到原始基因座，从而恢复游泳能力。
利什曼病和癌症共享的潜在治疗靶标
1伊朗设拉子式医学科学大学医学院寄生虫学和遗传学系； 2 IDISNA微生物学和寄生虫学系（纳瓦拉卫生研究所），C/ Irunlarrea 1，纳瓦拉大学，伊斯托图学院，西班牙帕姆普洛纳31008萨鲁德·萨鲁德·萨鲁德·萨鲁德学院； 3蛋白质组学单元，癌症研究中心（IBMCC/CSIC/USAL/IBSAL），西班牙Salamanca 37007； 4伊朗雅兹德的Shahid Sadoughi医学与卫生服务大学医学院免疫学系； 5北霍拉桑医学科学大学的媒介传播疾病研究中心，伊朗，伊朗； 6伊朗吉罗夫特医学科学大学医学院免疫学系； 7布什尔医学科学大学医学院微生物学和寄生虫学系，伊朗布什尔，伊朗和8个基础科学，传染病研究中心，设萨拉兹医学科学大学，伊朗Shiraz，伊朗，
以 CRISPR-Cas9 为主要靶点构建 PX-LmGP63，用于利什曼原虫 GP63 基因敲除及利什曼化
背景：利什曼原虫是一种细胞内原生动物寄生虫，它使用复杂的方法破坏哺乳动物宿主巨噬细胞的先天免疫反应。已发现许多因素会影响寄生虫致病性的严重程度。其中一个因素是 GP63，它是一组破坏宿主细胞信号传导机制的金属蛋白酶。目的：本研究旨在通过 CRISPR-Cas9 构建 PX-LMGP63 载体，用于利什曼原虫中的 GP63 基因敲除，作为一种潜在的利什曼化方法。方法：根据 GP63 的 mRNA 序列设计一对 gRNA。然后将退火引物克隆到线性化载体 PX-459 中并转化到 DH5 A 感受态细胞中。然后，使用基因特异性和载体引物进行 PCR 检测以确认菌落。此外，对构建的质粒进行测序以进行最终确认。结果：PCR证实了预期大小为270的条带。质粒测序显示gRNA789已连接到载体上。构建的结构被命名为PX-LMGP63，下一步将转染到前鞭毛体细胞中。结论：由于皮肤利什曼病在大多数国家流行并成为公共卫生问题，并且缺乏有效的利什曼病疫苗，使用CRISPR方法可能使未来获得有效的疫苗成为可能。
利什曼原虫中 RAD51 相关基因的条件性敲除揭示了同源重组在基因组复制过程中的关键作用
同源重组 (HR) 与基因组复制有着密切的关系，无论是在修复可能阻止 DNA 合成的 DNA 损伤期间，还是在解决复制叉停滞时。最近的研究让我们想知道 HR 是否在复制真核寄生虫利什曼原虫的基因组中发挥着更为核心的作用。关于 HR 基因是否必需，出现了相互矛盾的证据，而全基因组图谱为 DNA 复制起始位点（称为起源）的非正统组织提供了证据。为了回答这个问题，我们采用了 CRISPR/Cas9 和 DiCre 的组合方法来快速生成和评估利什曼原虫中 RAD51 和三种 RAD51 相关蛋白的条件性消融的影响。使用这种方法，我们证明任何这些 HR 因子的丧失都不会立即致命，但在每种情况下，生长都会随着时间的推移而减慢，并导致 DNA 损伤和具有异常 DNA 含量的细胞的积累。尽管存在这些相似之处，但我们表明，只有 RAD51 或 RAD51-3 的缺失才会损害 DNA 合成并导致全基因组突变水平升高。此外，我们还表明这两个 HR 因子的作用方式不同，因为 RAD51 的消融（而不是 RAD51-3）对 DNA 复制有重大影响，导致主要起点处的起始丧失和亚端粒处 DNA 合成增加。我们的工作澄清了有关 HR 对利什曼原虫生存的重要性的问题，并揭示了 RAD51 在微生物真核生物基因组复制程序中意想不到的核心作用。
使用 CRISPR 基因编辑技术开发的第二代利什曼病疫苗，该疫苗含有无标记减毒利什曼原虫株
。CC-BY-NC-ND 4.0 国际许可，根据 未经同行评审认证）是作者/资助者，他已授予 bioRxiv 永久展示预印本的许可。它是 由 此预印本的版权持有者（此版本于 2020 年 5 月 5 日发布。 ; https://doi.org/10.1101/2020.05.04.077115 doi: bioRxiv preprint
接种莱蒂芬特疫苗，一种新型犬利什曼病 - ...
疫苗接种可能会引发抗体的产生，而这种抗体可以通过标准诊断技术检测到。这一事实可能无法实现感染动物与疫苗接种动物的鉴别 (DIVA) (1)。DIVA 疫苗可以对易感动物群体进行大规模疫苗接种，而不会影响恢复期个体的血清学鉴定。在犬利什曼病中，可以通过标准诊断技术检测到对疫苗的抗体反应，从而无法区分接种疫苗的狗和自然感染的狗。此外，接种疫苗的狗体内的抗利什曼抗体水平可能在数月内都能检测到 (2, 3)。最近，欧盟委员会已授予 LetiFend ® 上市许可。该疫苗的有效成分是 Protein Q，这是一种由 L. infantum 细胞内蛋白的五个抗原片段基因融合形成的重组蛋白 (3)。LetiFend ® 适用于 6 个月以上未感染狗的主动免疫，以降低接触 L. infantum 后发生活动性感染和/或临床疾病的风险。 LetiFend ® 的疫苗接种疗程为一次注射，随后每年进行加强注射。本研究旨在评估 LetiFend ® 疫苗接种对多种 L. infantum 血清学诊断测试的潜在干扰。
在人畜共患性皮肤利什曼病的流行病区域中的流行病学研究伊朗
这项研究是在1991 - 92年在伊斯法罕市以北的一个乡村地区的Borkhar的12个月内在伊朗伊斯兰共和国中部进行的。目的是确定利什曼病的自然储层宿主的生态，以实现利什曼原虫疫苗的未来现场试验。该地区的主要储层主机是菱形Opimus，Great Gerbil，其次是Meriones Libycus，Libyan Jird和Hemiechinus Auritis，Longeared Hedgehog。在Borkhar地区检查的179个小型哺乳动物中，绝大多数是R. Opimus（82.1％），然后是M. Libycus（15.7％）和最后一h. Auritis（2.2％）。R. opimus的最高感染率为9月（90.5％），在不同村庄的率在22.2％和80.4％之间。M. libycus的平均感染率为17.9％。这些啮齿动物可能是储层宿主在该地区人畜共患病的流行病学中起重要作用。十六只家养犬和流浪狗似乎未感染，因为检查没有活跃的病变或疤痕。