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遗传学 利用 dCas9 控制的 CRISPR/Cas3 在哺乳动物细胞和小鼠中产生精确的大片段缺失
目前，Cas9 和 Cas12a 系统被广泛用于基因组编辑，但它们精确产生大片段染色体缺失的能力有限。I-E 型 CRISPR 介导广泛和单向的 DNA 降解，但迄今为止，控制 Cas3 介导的 DNA 缺失的大小已被证明是难以捉摸的。在这里，我们证明了 Cas9 的内切酶失活 (dCas9) 可以精确控制哺乳动物细胞中 Cas3 介导的大片段缺失。此外，我们分别报告了使用 CRISPR/Cas3 和 dCas9 控制的 CRISPR/Cas3 在小鼠中消除 Y 染色体和精确保留 Sry 基因。总之，dCas9 控制的 CRISPR/Cas3 介导的精确大片段缺失为通过染色体消除建立动物模型提供了一种方法。该方法也有望成为治疗涉及额外染色体的片段突变或人类非整倍体疾病的潜在治疗策略。
转录因子凝结物的工程材料特性控制哺乳动物细胞和小鼠中的基因表达
和进一步经历了同性恋，导致多价相互作用和LLP的诱导。VP16被募集到CMV最小启动子提供的转录起始位点，并诱导报告基因表达。（b）调整转化因子冷凝物的材料特性。要修改凝结物材料特性，采用了两种策略：首先，通过将CRY2换成Cry2 Olig，从而增加了相互作用的价值，而Cry2 Olig构成了高阶寡聚物；其次，通过共转染编码融合到麦克里（可视化）和fus n和nLS的cry2 olig的结构来提高价值和浓度。与CRY2-EYFP-FUS N -VP16或CREY2 OLIG -EYFP-FUS N -VP16构建体（黄色和绿色数据点）共转染了编码CIBN-TER和基于TETO 4的SEAP报告基因。可选地，添加了编码Cry2 Olig -MCH -MCH -FUS n -nls的构造（以2：1的质粒量比为2：1相对于含VP16的构建体，红色和黑色数据点）。在进行FRAP分析之前，将细胞在黑暗中培养32小时。蓝光照明10分钟后（2.5 µmol m -²S-1）开始。 图像在液滴漂白之前直接显示出反应性核。比例尺= 5 µm。 图显示了根据n≥7凝结物回收曲线的非线性拟合计算出的移动部分的平均值和单个值（请参见右图）。 使用学生的t.test（*=p≤0.05; **** =p≤0.0001）进行成对比较。。图像在液滴漂白之前直接显示出反应性核。比例尺= 5 µm。图显示了根据n≥7凝结物回收曲线的非线性拟合计算出的移动部分的平均值和单个值（请参见右图）。使用学生的t.test（*=p≤0.05; **** =p≤0.0001）进行成对比较。
在哺乳动物细胞中细菌亮氨酸tRNA的定向进化，以增强非规范氨基酸诱变
图2。tRNA leu库设计和下一代测序选择数据。a）受体茎的序列对齐的WEBLOGO表示来自682个细菌trNA，表明每个位置在每个位置的每个残基相对丰度。编号方案相对于tRNA ecleu（面板b）。b）野生型大肠杆菌tRNA cuA leu的三叶草结构，通过随机使受体词干碱基对随机使图书馆生成方案。基础配对均通过根据框中显示的彩色方案在每个位置引入每个位置的成对替换来维护。随机化被限制以维持保守的序列元素（面板A）。c）在选择之后和之前，使用其在文库中的标准化丰度（以前/以前/丰度）在库中测量了库中每个突变体在库中的富集。进行了选择的两种生物学重复，并彼此绘制了这两种重复物中观察到的每个突变体的富集。d）显示了最高1％（最丰富）序列的共识序列。提供了WT-TRNA ecleu的序列作为参考。e）在存在或不存在1 mM帽的情况下，通过将每个tRNA ecleu突变体的活性与PLRS1和EGFP-39TAG一起转染中，与PLRS1和EGFP-39TAG进行了测试（另请参见图S5）。在无细胞提取物中测量了EGFP-39TAG的表达，
Q5A(R2) 源自人类或动物细胞系的生物技术产品的病毒安全性评估
人用药品注册技术要求国际协调会 (ICH) 的使命是实现全球监管的更大协调，以确保以最节省资源的方式开发、注册和维护安全、有效和高质量的药品。通过协调世界各地区的监管期望，ICH 指南大大减少了重复的临床研究，避免了不必要的动物研究，标准化了安全报告和上市申请提交，并促进了全球药物开发和制造以及患者可用产品的质量的许多其他改进。ICH 是一个以共识为导向的过程，监管机构和行业各方的技术专家参与详细的技术和科学协调工作，最终制定出 ICH 指南。全球监管机构承诺一致采用这些基于共识的指南，对于实现安全、有效和高质量的药物对患者和行业的好处至关重要。作为 ICH 的创始监管成员之一，美国食品药品管理局 (FDA) 在每项 ICH 指南的制定中发挥着重要作用，这些指南随后被 FDA 采纳并发布作为行业指导。
铜（II）肽螺旋在哺乳动物细胞中选择性切割DNA复制灶
体外和在哺乳动物细胞中的DNA复制灶。这是实现此类城市的第一次。3WJ是最简单的分支DNA结构，14由由三个收敛的dsDNA单元形成的对称组件组成，它们在一个称为分支点的中心点相遇，该单位形成了直径约为12Å的直径约为12Å，由三个B-DNA Arm臂的终端底座对de de de ned。15属金属分子螺旋螺旋物是选择性识别这些非规范性DNA结构的最合理的药物。6 - 12其选择性的关键因素之一是它们的形状与3WJ的分支点的三角对称性之间的高互补性。的确，这是其他3WJ粘合剂的关键结构特征，例如三联烯衍生物，16 C 3-对称阳离子azacryptands，17个自组装超分子超分子Fe II四面体金属金属18和3倍对称三倍的三肽。19
Transformer 碱基编辑器在哺乳动物细胞和小鼠中的设计与应用
将载脂蛋白 B mRNA 编辑酶、催化性多肽样胞苷脱氨酶与催化功能受损的 Cas 蛋白（例如 nCas9 或 dCas9）融合，提供了一种新型基因编辑技术，即碱基编辑，可高效地实现靶向碱基替换。然而，在碱基编辑中观察到全基因组和全转录组脱靶突变，这引发了对治疗应用的安全性担忧。之前，我们开发了一种新的碱基编辑系统，即 transformer 碱基编辑器 (tBE)，可在哺乳动物细胞和小鼠中诱导高效编辑，且不会观察到全基因组或全转录组脱靶突变。这里我们描述了设计和应用 tBE 的详细方案。本方案包括设计单向导 RNA (sgRNA) 和辅助 sgRNA 对、构建构建体、确定全基因组和转录组范围的脱靶突变、生产含有 tBE 的腺相关病毒、将腺相关病毒递送到小鼠体内以及检查体内编辑效果的步骤。使用 sgRNA-辅助 sgRNA 对，tBE 的高精度碱基编辑可以在 2-3 周内（在哺乳动物细胞中）或 6-8 周内（在小鼠中）完成。整个过程可以由研究人员使用分子生物学、生物信息学和小鼠饲养的标准技术共同完成。
定量分析和优化哺乳动物细胞中位点特异性蛋白生物结合
摘要：尽管有多种共价蛋白质修饰，但很少有用于定量细胞中蛋白质生物结合的技术。在这里，我们描述了一种通过与Halotag共价键形成在纤维素蛋白生物偶联中量化的新方法。这种方法利用不自然的氨基酸（UAA）诱变选择性地在蛋白质表面上安装小而生物串管的反应性手柄。我们利用了反电子二极管的快速动力学和高选择性 - 评估四嗪苯丙氨酸（TETF）与紧张的反甲环烯 - 氯酸酯（STCO-CA）（STCO-CA）和跨循环链烯（TETR-caclecten）（TETR-CATRE）的反应（TETF）与TETRECANE（TETRE）（TETER-CARORE（TETRE）。生物缀合后，叶绿素配体暴露于释放酶标记，以通过简单的蛋白质印迹分析直接定量生物缀合。我们证明了该工具的多功能性，以快速，准确地确定不同UAA/氯烷烃对的生物缀合效率以及对不同蛋白质的不同位点（包括EGFP和雌激素相关的受体ERR）的不同位点。■简介
辐射杂种的汇总分析确定了哺乳动物细胞生长和药物作用的基因座
TN5转座子标记双链DNA和RNA/DNA杂交产生的核酸，这些核酸准备被放大以进行高通量测序。必须探索TN5转座子的核酸底物以增加TN5的应用。在这里，我们发现TN5转座子可以将寡核酸转置超过140个核苷酸的单链DNA的5'端。基于TN5的此属性，我们开发了一种基于标记和启用连接的单链DNA测序方法，称为Table-Seq。通过一系列反应温度，时间和酶浓度测试，我们将表格seq应用于链特异性的RNA测序，从总RNA的30 pg开始。此外，与传统的基于DUTP特异性的RNA测序相比，该方法检测到更多的基因，具有较高的链特异性，并且在基因之间显示出更均匀分布的读数。一起，我们的结果提供了有关TN5转座子特性的见解，并扩展了TN5在尖端测序技术中的应用。
工具用于定量分馏哺乳动物细胞的一般方法
引言真核核被核包膜（NE）包围，并以染色体形式包含大部分细胞的遗传物质（Clark等，2019; Webster等，2009）。它代表了几个膜 - 分隔的细胞器中最突出的，每个细胞器都有其自身和动态的组成（Cohen等，2018; Cole，2016; Schrader等，2015）。大分子的核质运输是在cy- toplasm和核之间发生的连续高度调节过程（Alberts等，2002; Christie等，2016; MacAra，2001; MacAra，2001; Silver，1991; Silver，1991; Wente and watee and Rout，2010; Yoneda; Yoneda》，1997年）。每种大分子的正确核细胞质定位是维持细胞稳态的关键（Bauer等，2015； Park等，2011）。分子进出核的转运是由嵌入在NE中的核孔复合物（NPC）所介绍的。单个NPC由约30种不同蛋白质的多个拷贝组成，称为核苷（Nups; Dultz等，2022; Stewart，2022; Tingey et al。，2022; Wing et al。，2022），并且不仅对核细胞的运输量不仅对核细胞的依恋; Al。，2022）。蛋白质的异常核细胞质定位已与许多人类疾病的发病机理有关，例如癌症，代谢，心血管和神经模型 - 生成性疾病（Chung等，2018; Holmes et al。有几种机制可能导致蛋白质错误定位，例如贩运机制的改变，蛋白质靶向信号的改变以及蛋白质的变化更具体地说，癌蛋白，抑制剂和其他与癌症相关的蛋白质的错误定位会干扰正常的细胞稳态，并导致肿瘤发育和转移（Wang and Li，2014）。
第三单元 - 微生物，动植物，动物细胞，器官培养...
Gottlieb Haberlandt是奥地利植物学家。他是欧洲“大豆”先驱教授弗里德里希·J·哈伯兰特的儿子。Haberlandt首先指出了孤立组织和植物组织培养的可能性。他提出了通过组织培养的单个细胞的潜力，还提出了组织的相互影响可以通过这种方法来确定。哈伯兰特（Haberlandt）针对组织和细胞培养的原始断言方法已经实现，从而导致了生物学和医学的重要发现。他在1902年提出的最初想法被称为Totipentiality：“从理论上讲，所有植物细胞都能够产生完整的植物。”Gottlieb Haberlandt在1904年给出了Kranz（德语）解剖学一词，以描述陆地植物中更高效的C4光合作用中发现的专门叶片解剖结构。