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World File Search System扩增子
针对恶性疟原虫多样性和抗性的灵敏和模块化扩增子测序，用于研究和公共卫生
。CC-BY-NC 4.0 国际许可下可用（未经同行评审认证）是作者/资助者，他已授予 bioRxiv 永久展示预印本的许可。它是此预印本的版权持有者此版本于 2024 年 8 月 25 日发布。；https://doi.org/10.1101/2024.08.22.609145 doi：bioRxiv 预印本
使用瓷砖扩增子（Heptile）和基于探针的富集在Illumina和Nanobore平台上的整个基因组测序
乙型肝炎病毒（HBV）全基因组测序（WGS）目前受到限制，因为许多临床样品的DNA病毒载荷（VL）低于使用当前测序方法产生完整基因组所需的阈值。我们使用基于探针的捕获和瓷砖放大器PCR（Hep-tile）开发了两种泛基因型病毒富集方法，用于HBV WGS。我们使用模拟样品证明了这两种富集方法都是泛基因型（基因型A-J）。使用临床样品，我们证明了HEP-TILE放大成功地放大了最低的HBV VL测试（30 IU/ mL）的完整基因组，并且可以使用纳米孔和Illumina平台对PCR产物进行测序。基于探针的捕获，具有Illumina测序需要VL> 300,000 IU/mL，以生成全长HBV基因组。捕获 - 紫罗兰和Hep-tile-nanopore管道在具有已知DNA序列的模拟样品中具有100％的共识测序精度。一起，这些方案将促进HBV序列数据的产生，从而使HBV分子流行病学的更准确，更具有代表性的描述，对持久性和发病机理进行启示，并增强对感染及其治疗结果的理解。
靶向扩增子深度测序用于监测肯尼亚西部的抗疟药耐药性标志物
摘要 恶性疟原虫的分子监测对于追踪新出现的突变和已发现突变的趋势非常重要，应作为抗疟药耐药性的早期预警系统。2019 年，在肯尼亚西部八个县对学童进行了恶性疟原虫疟疾调查，从调查中获取了干血斑。实时 PCR 鉴定出 500 个恶性疟原虫阳性样本，这些样本在五个耐药位点进行了扩增，以进行靶向扩增子深度测序 (TADS)。重要的 kelch 13 突变的缺失与 2019 年前肯尼亚的发现相似，在密码子 569 和 578 中观察到低频突变。氯喹抗性转运蛋白基因密码子 76 和 145 为野生型，表明寄生虫分别对氯喹和哌喹敏感。基于密码子 86、184 和 199 的多药耐药基因 1 单倍型主要存在于单倍型 NYT 和 NFT 的混合感染中，分别由缺乏氯喹压力和使用苯芴醇驱动。磺胺多辛-乙胺嘧啶耐药性谱是 Pfdhfr（51I 59R 108N）和 Pfdhps（436H 437G 540E）三重突变的“超级耐药”组合，导致磺胺多辛-乙胺嘧啶无效。TADS 突出显示了低频变异，从而可以尽早识别新的突变、Pfmdr1 密码子 199S 和 Pfdhfr 密码子 85I 以及新出现的 164L 突变。TADS 的附加价值在于它能够准确地识别混合基因型感染并进行抗疟药耐药性标志物的高通量监测。
改进了基于16S rRNA基因扩增子的微生物组研究的DNA提取和扩增策略。
摘要：下一代测序技术通过启用微生物组的社区级序列分析来推动人类微生物组研究的快速发展。尽管所有微生物组测序方法都取决于从样品中恢复DNA作为第一个关键步骤，但裂解方法可能是微生物组谱偏差的主要决定因素。基于温和的酶的DNA制备方法可保留DNA质量，但可以通过未能打开难以溶的细菌来偏向结果。诸如珠子跳动之类的机械方法也会偏向DNA恢复，因为打破较硬的细胞壁所需的机械能可以剪切更容易裂解的微生物的DNA，并且剪切可能会根据跳动的时间和强度而变化，从而影响重复性。我们引入了一种非机械，非酶，新型的新型快速微生物DNA提取程序，适用于16S基因基因基因的微生物组分析应用，以消除珠子的跳动。同时应用碱性，热量和洗涤剂（“快速”方案）在毫克量样品中提供了一致的在困难且易于裂解的细菌等于或更好的群体中，与现有方案相等或更好，从而产生足够的高素质DNA，用于全长长度16S RRNA基因PCR。使用包含困难和易于裂解细菌的模拟细菌群落评估了新型的“快速”方法。人类粪便样品测试将新型快速方法与标准的人类微生物组项目（HMP）方案进行了比较，该方案为肺癌患者和对照组的样品进行了比较。使用PACBIO平台上的V1V3和V4区域的V1V3和V4区域的16S rRNA基因测序分析了从两种方法中恢复的DNA。我们的发现表明，“快速”方案始终产生较高水平的公司物种，这些物种更准确地反映了细菌群落结构的特征，这通过模拟社区评估证实。新型的“快速” DNA裂解协议减少了珠子跳动和酶裂解方法常见的种群偏见，提供了改善微生物社区分析的机会，并结合了将样品输入减少到10毫克或更低的情况，并且可以启用快速传递和同时传递标准板格式中96个样品的裂解。与广泛使用的商业方法相比，这会导致样品处理时间的降低20倍，总体优势降低了2倍。我们得出结论，新型的“快速” DNA提取方案为16S rRNA基因扩增子测序的粪便提供了可靠的替代方法。
服务指南全质粒和Amplicon Express ...
整个质粒和Amplicon Express的测序配置为150bp配对的末端。因此，索引ED扩增子的长度应在150-250bp之间（这是靶向扩增子的长度减去NEX TERA标签）。在同一测序运行中具有不同大小的放大器，例如两个极端：150bp和250bp，可能会产生不同数量的测序读数。这是由于较小尺寸群集的扩增子在流动池上更有效地簇，从而导致其在测序池中较高的表示（从而产生更多数据）。AGRF将采用汇总偏移量来解释大小的差异，并最大程度地减少测序读数的可变性。短PCR扩增子不应包含任何内部修饰，荧光团或深色淬火器。服务仅在珀斯可用。4.0样本提交要求
来自东非裂谷的三个苏打湖的原核和真核微生物多样性，由扩增子测序确定
苏打湖是具有高碱度和盐分的独特聚会环境，尽管具有极端的性质，但仍支持各种微生物群落。在这项研究中，使用Amplicon测序确定了三个苏打湖，阿比亚塔湖，Chitu湖和沙拉湖的样品中的原核和真核微生物多样性。与培养的分析显示，所有三个苏打湖中原核和真核微生物群落的多样性都比以前报道的要高。通过非依赖性的扩增子测序发现了总共3,603个原核生物和898个真核操作分类单元（OTU），而只有134个细菌Otus仅通过丰富的培养物获得3％。这表明在实验室条件下只能培养这些栖息地的微生物的一部分。在三个苏打湖中，来自奇图湖的样品显示出最高的原核多样性，而沙拉湖的样品显示出最低的多样性。Pseudomonadota ( Halomonas ), Bacillota ( Bacillus , Clostridia ), Bacteroidota ( Bacteroides ), Euryarchaeota ( Thermoplasmata , Thermococci , Methanomicrobia , Halobacter ), and Nanoarchaeota ( Woesearchaeia ) were the most common prokaryotic microbes in the three soda lakes.鉴定出高度多样性的真核生物，主要由Ascomycota和basidiomycota代表。与其他两个湖泊相比，在阿比亚塔湖（Lake Abijata）发现了更多的真核OTU。本研究表明，这些独特的栖息地具有多种微生物遗传资源，并可能在生物技术应用中使用，应通过功能性宏基因组学进一步研究。
多重连接依赖性探针扩增（MLPA）
大小标准由已知长度的荧光标记 DNA 片段组成，可作为分子标尺。大小标准标记的荧光染料与 MLPA 探针产品不同。当片段根据大小迁移时，毛细管电泳仪中的检测器会检测到大小标准和 MLPA 扩增子的荧光 - 小片段比大片段通过得更快。将每个 MLPA 扩增子的迁移与大小标准的每个片段的迁移进行比较，以确定大小，从而确定 MLPA 扩增子的身份。
高通量快速扩增子测序，用于来自存档的临床DNA样品的支原体卵巢卵的多焦点序列
遗传多样性的宿主范围（1，3）。 卵巢支原体的遗传多样性含量很高，表明它们是重要的储层和感染来源的作用，而在BHS中，它很低，表明溢出物是主要的传输来源（1）。 的确，来自多层次序列分型（MLST）序列对祖先序列的状态重建证实了家用绵羊作为BHS的主要感染来源，强调了菌株键入对映射传输动力学的重要性（4）。 在BHS中，最初发生致命支气管瘤的爆发通常是在羔羊中反复发生的致命爆发。 在初始溢出后的2到15年观察到了反复爆发（2，5 - 7）。 最近的证据表明，可能没有跨支架免疫，使存活的动物容易感染（4，8）。 为了减少溢出事件的可能性，联邦和州机构实施了针对国内和野羊的空间分离的政策（9）。 最近在美国西部和加拿大进行了增加的采样工作，以发现10个州和三个省份的Ovipneumoniae大分枝杆菌的流行率（10）。遗传多样性的宿主范围（1，3）。卵巢支原体的遗传多样性含量很高，表明它们是重要的储层和感染来源的作用，而在BHS中，它很低，表明溢出物是主要的传输来源（1）。的确，来自多层次序列分型（MLST）序列对祖先序列的状态重建证实了家用绵羊作为BHS的主要感染来源，强调了菌株键入对映射传输动力学的重要性（4）。在BHS中，最初发生致命支气管瘤的爆发通常是在羔羊中反复发生的致命爆发。在初始溢出后的2到15年观察到了反复爆发（2，5 - 7）。最近的证据表明，可能没有跨支架免疫，使存活的动物容易感染（4，8）。为了减少溢出事件的可能性，联邦和州机构实施了针对国内和野羊的空间分离的政策（9）。最近在美国西部和加拿大进行了增加的采样工作，以发现10个州和三个省份的Ovipneumoniae大分枝杆菌的流行率（10）。
基于纳米孔的RSV整个基因组测序
（棕色），只有G基因（深红色）和缺失的G和F基因测序（也称为深绿色的“其他”），分别由DNA纯化（紫色）救出。在基因组位置（蓝色）和（红色）PCR扩增子清理的基因组位置的测序代表性RSV-A（E）和RSV-B（f）的覆盖深度。bar图显示了NGS的折叠变化读取的映射到未经PCR扩增子纯化的未经和带有PCR扩增的放大器的测序样品和高（g）和高（H）浓度的RSV参考基因组。将洗涤的PCR扩增子的库的 ngs读取为标准化，并表示为对未洗的PCR扩增子的折叠更改，该折叠设置为1。。 数据表示为平均值±SD。 进行 t检验分析的统计显着性。 p值小于0.05被认为具有统计学意义，并将其标记为 *。ngs读取为标准化，并表示为对未洗的PCR扩增子的折叠更改，该折叠设置为1。数据表示为平均值±SD。t检验分析的统计显着性。p值小于0.05被认为具有统计学意义，并将其标记为 *。
22-2172.意见.12-20-2024_2439717.pdf
IDT 辩称，它并未放弃其权利要求解释论点，因为委员会在其最终书面决定中对“每条链”限制的解释与该术语的普通含义不一致，而双方在下文的整个程序中都依赖该术语的普通含义。上诉人的答复，第 16-18 条。但是，委员会只应用了被质疑权利要求的普通含义，其中没有提到“完全消除短扩增子”。例如，见决定*9。如果 IDT 认为需要完全消除短扩增子，或者必须将短扩增子降低到不主导 PCR 扩增过程的水平，则 IDT 必须向委员会提出这些论点以在上诉中保留它们。