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对 ama1 和 mdr1 进行靶向扩增子深度测序以...
1 肯尼亚基利菲 KEMRI-Wellcome Trust 研究计划生物科学系 2 北卡罗来纳大学教堂山分校医学院医学系传染病科，北卡罗来纳州教堂山 27599，美国 3 牛津大学纳菲尔德医学系热带医学与全球健康中心，英国牛津 4 玛希隆大学热带医学院玛希隆-牛津热带医学研究组，泰国曼谷 5 布朗大学沃伦·阿尔珀特医学院病理学与实验室医学系，罗德岛州普罗维登斯 02903，美国 6 北卡罗来纳大学教堂山分校吉林斯全球公共卫生学院流行病学系，北卡罗来纳州教堂山 27516，美国 7 北卡罗来纳大学教堂山分校医学院遗传学与分子生物学课程，北卡罗来纳州教堂山，美国
使用牛津纳米孔扩增子测序的温室灌溉水中真菌和卵菌病原体的早期评估
水传播植物的致病真菌和卵菌是温室生产系统中的主要威胁。对这些病原体的早期检测和量化将使我们能够及时治疗所需的经济和生物阈值，从而改善有效的疾病管理。在这里，我们使用了牛津纳米孢子的扩增子来分析从用于生长番茄，黄瓜和Aeschynanthus sp的温室收集的灌溉水中的微生物群落。真菌和卵形群落的特征是使用放大整体内部转录垫片（ITS）区域的引物。为了评估小兵测序的灵敏度，我们将串行稀释的模拟DNA刺激到图书馆制备之前从温室水样品中分离的DNA中。真菌和卵骨读数的相对丰盛在温室灌溉水中和来自番茄番茄的设置中的水样中与众不同。在相应的连续稀释样品中衍生出的源自真菌和卵形模拟群落的序列读数是成比例的，因此确认了最小值扩增子测序对环境监测的适用性。通过使用尖峰标准来测试使用小兵测试定量的可靠性，我们发现样品中尖峰ins的检测受到了真菌或卵形DNA的背景量的高度影响。我们观察到，与较长的尖峰（> 790bp）相比，我们大多数稀释液的长度较短（538bp）的尖峰在我们的大部分稀释液中产生。此外，相对于稀释序列，序列读数不均匀，并且在具有最高DNA浓度的背景样品中最不可检索，这表明性能的动态范围狭窄。我们建议对小兵测序进行连续的基准测试，以改善未来快速植物性诊断和监测的定量元编码工作。
真核ITS和rRNA扩增子的全长HIFI测序
与简短的读数相比，覆盖范围仅限于ITS1或ITS2区域，HIFI读取的读数涵盖了全真菌其区域的全长。这包含800 bp，如果包括18s和/或28S基因以跨越操纵子，则可以提供约5 kb的扩增子。以及更保守的rRNA基因，这些区域允许在物种水平上降低序列相似性和更高分辨率的分类信息（Tedersoo等，2018； Tedersoo等人，2021年，图2）。除了产生更高的分类价值外，HIFI全长扩增子测序的成本与短阅读的部分扩增子测序相当。在本申请注释中，我们提供了从复杂社区DNA样品中扩增全长真核ITS和rRNA区域的一般指导。
线性扩增子测序分析报告/结果
下面的直方图显示了测序数据的读取长度分布。直方图在 y 轴上显示测序碱基数 (bp)，在 x 轴上显示读取长度。直方图中的每个条形代表读取长度的范围，条形的高度表示该范围内的碱基总数 (bp)。这会产生按每个箱体的核苷酸数加权的图，因为较长的读取在直方图中具有更大的权重。读取长度直方图可用于评估测序数据的质量，因为读取长度的分布可以指示测序过程中是否存在污染物或偏差。它们还可用于确定正在测序的扩增子的大小。
错误、嵌合体、偏差和 GC 含量对扩增子测序准确性的影响
摘要 靶向扩增子测序广泛应用于微生物生态学研究。然而，测序伪影和扩增偏差令人担忧。为了确定这些伪影的来源，我们使用由来自 33 种细菌菌株的 16S rRNA 基因组成的模拟群落进行了系统分析。我们的结果表明，虽然测序错误通常只发生在低丰度操作分类单元中，但嵌合序列是伪影的主要来源。单序列和双序列主要是嵌合体。嵌合序列的形成与目标序列的 GC 含量显着相关。低 GC 含量的模拟群落成员表现出较低的嵌合序列形成率。GC 含量对序列恢复也有很大影响。定量能力明显有限，恢复率差异很大，预期和观察到的菌株丰度之间的相关性较弱。GC 含量较高的模拟群落菌株的恢复率高于 GC 含量较低的菌株。由于引物亲和力的差异，还观察到了扩增偏差。两步 PCR 策略将嵌合序列的数量减少了一半。此外，基于模拟群落的比较分析表明，几种广泛使用的序列处理流程/方法，包括DADA2、Deblur、UCLUST、UNOISE和UPARSE，在伪影去除和稀有物种检测方面各有优缺点。这些结果对于提高测序质量和可靠性以及开发新的算法来处理目标扩增子序列具有重要意义。
来自东非裂谷的三个苏打湖的原核和真核微生物多样性，由扩增子测序确定
苏打湖是具有高碱度和盐分的独特聚会环境，尽管具有极端的性质，但仍支持各种微生物群落。在这项研究中，使用Amplicon测序确定了三个苏打湖，阿比亚塔湖，Chitu湖和沙拉湖的样品中的原核和真核微生物多样性。与培养的分析显示，所有三个苏打湖中原核和真核微生物群落的多样性都比以前报道的要高。通过非依赖性的扩增子测序发现了总共3,603个原核生物和898个真核操作分类单元（OTU），而只有134个细菌Otus仅通过丰富的培养物获得3％。这表明在实验室条件下只能培养这些栖息地的微生物的一部分。在三个苏打湖中，来自奇图湖的样品显示出最高的原核多样性，而沙拉湖的样品显示出最低的多样性。Pseudomonadota ( Halomonas ), Bacillota ( Bacillus , Clostridia ), Bacteroidota ( Bacteroides ), Euryarchaeota ( Thermoplasmata , Thermococci , Methanomicrobia , Halobacter ), and Nanoarchaeota ( Woesearchaeia ) were the most common prokaryotic microbes in the three soda lakes.鉴定出高度多样性的真核生物，主要由Ascomycota和basidiomycota代表。与其他两个湖泊相比，在阿比亚塔湖（Lake Abijata）发现了更多的真核OTU。本研究表明，这些独特的栖息地具有多种微生物遗传资源，并可能在生物技术应用中使用，应通过功能性宏基因组学进一步研究。
靶向扩增子深度测序用于监测肯尼亚西部的抗疟药耐药性标志物
摘要 恶性疟原虫的分子监测对于追踪新出现的突变和已发现突变的趋势非常重要，应作为抗疟药耐药性的早期预警系统。2019 年，在肯尼亚西部八个县对学童进行了恶性疟原虫疟疾调查，从调查中获取了干血斑。实时 PCR 鉴定出 500 个恶性疟原虫阳性样本，这些样本在五个耐药位点进行了扩增，以进行靶向扩增子深度测序 (TADS)。重要的 kelch 13 突变的缺失与 2019 年前肯尼亚的发现相似，在密码子 569 和 578 中观察到低频突变。氯喹抗性转运蛋白基因密码子 76 和 145 为野生型，表明寄生虫分别对氯喹和哌喹敏感。基于密码子 86、184 和 199 的多药耐药基因 1 单倍型主要存在于单倍型 NYT 和 NFT 的混合感染中，分别由缺乏氯喹压力和使用苯芴醇驱动。磺胺多辛-乙胺嘧啶耐药性谱是 Pfdhfr（51I 59R 108N）和 Pfdhps（436H 437G 540E）三重突变的“超级耐药”组合，导致磺胺多辛-乙胺嘧啶无效。TADS 突出显示了低频变异，从而可以尽早识别新的突变、Pfmdr1 密码子 199S 和 Pfdhfr 密码子 85I 以及新出现的 164L 突变。TADS 的附加价值在于它能够准确地识别混合基因型感染并进行抗疟药耐药性标志物的高通量监测。
基于扩增子的下一代分析和临床验证
。CC-BY-NC-ND 4.0 国际许可证 它是永久可用的。 是作者/资助者，已授予 medRxiv 许可以显示预印本（未经同行评审认证）预印本 此版本的版权所有者于 2021 年 8 月 8 日发布。；https://doi.org/10.1101/2021.08.03.21261575 doi：medRxiv 预印本
使用EXO-CIP™快速PCR清理套件处理的PCR扩增子对基因组编辑效率进行快速分析，然后是Sanger测序
对于CRISPR/CAS工作流程，核酸酶和相应GRNA的选择直接影响基因组编辑后的indel频率的计算。当前用于评估编辑效率的当前METH OD使用来自转染的细胞的合并GDNA的PCR扩增，然后是基于测序或基于测序的基于测序或基于不匹配的裂解的分析分析的变性和重新启动的indneal indneal indneal DNA（4）。为加快编辑效率的确定并避免昂贵的NG测序，“通过分解来跟踪Indels”（Tide）（5）和“ CRISPR编辑的推断”（ICE）方法（6）是开发用于使用sanger sequenc dna sequenceenc dna dna dna dna dna dna dna dna dna dna dna dna dna dna（ice）方法（ICE）方法（ICE）方法（ICE）。但是，要使这些方法可靠，分析的PCR产品必须具有高质量（例如，单个频带，没有底漆和DNTP）。在本文中，我们证明了通过Exo-CIP快速PCR清洁套件方法清理的扩增子质量匹配，该方法是通过使用ICE软件工具进行批处理分析的传统基于旋转柱的套件来实现的，从而启用了更快，更高的推出方法，以制备旋转后的样品，用于旋转后的样品。
单细胞 DNA 扩增子测序揭示克隆......
T 细胞急性淋巴细胞白血病 (T-ALL) 是一种侵袭性白血病，最常见于儿童，其特征是在诊断时存在少量染色体重排和蛋白质编码区 10 至 20 个体细胞突变。大多数 T-ALL 病例都含有 NOTCH1 中的激活突变以及与激酶信号传导、转录调控或蛋白质翻译有关的基因突变。为了更深入地了解诊断和治疗期间的克隆异质性水平，我们使用 Tapestri 平台进行单细胞靶向 DNA 测序。我们设计了一个定制的 ALL 面板，并获得了精确的单核苷酸变异和小插入-缺失突变，需要 305 个扩增子，覆盖每个样本和时间点约 4400 个细胞中的 110 个基因。对 8 名 T-ALL 患者的 25 个样本共分析了 108 188 个细胞。我们通常在诊断时观察到一个主要克隆（> 35% 的细胞），伴随几个次要克隆，其中一些克隆占细胞总数的不到 1%。四名患者有 > 2 个 NOTCH1 突变，其中一些存在于次要克隆中，表明在发育中的 T-ALL 细胞中获得 NOTCH1 突变的压力很大。通过分析纵向样本，我们检测到残留的白血病细胞和克隆的存在和克隆性质，这些细胞和克隆在诊断时存在较少，在疾病后期发展为临床相关的主要克隆。因此，单细胞 DNA 扩增子测序是一种灵敏的检测方法，可用于检测 T-ALL 中的克隆结构和进化。（Blood . 2021;137(6):801-811）