XiaoMi-AI文件搜索系统
World File Search System扩增子
使用牛津纳米孔扩增子测序的温室灌溉水中真菌和卵菌病原体的早期评估
水传播植物的致病真菌和卵菌是温室生产系统中的主要威胁。对这些病原体的早期检测和量化将使我们能够及时治疗所需的经济和生物阈值，从而改善有效的疾病管理。在这里，我们使用了牛津纳米孢子的扩增子来分析从用于生长番茄，黄瓜和Aeschynanthus sp的温室收集的灌溉水中的微生物群落。真菌和卵形群落的特征是使用放大整体内部转录垫片（ITS）区域的引物。为了评估小兵测序的灵敏度，我们将串行稀释的模拟DNA刺激到图书馆制备之前从温室水样品中分离的DNA中。真菌和卵骨读数的相对丰盛在温室灌溉水中和来自番茄番茄的设置中的水样中与众不同。在相应的连续稀释样品中衍生出的源自真菌和卵形模拟群落的序列读数是成比例的，因此确认了最小值扩增子测序对环境监测的适用性。通过使用尖峰标准来测试使用小兵测试定量的可靠性，我们发现样品中尖峰ins的检测受到了真菌或卵形DNA的背景量的高度影响。我们观察到，与较长的尖峰（> 790bp）相比，我们大多数稀释液的长度较短（538bp）的尖峰在我们的大部分稀释液中产生。此外，相对于稀释序列，序列读数不均匀，并且在具有最高DNA浓度的背景样品中最不可检索，这表明性能的动态范围狭窄。我们建议对小兵测序进行连续的基准测试，以改善未来快速植物性诊断和监测的定量元编码工作。
使用重组 Cas9 核酸酶评估基因组编辑实验中的位点修饰的方案
简介 用 Cas9 核糖核蛋白 (Cas9 核酸酶) 体外消化 PCR 扩增子是一种灵敏的插入/缺失检测方法。与错配检测方法不同，Cas9 还具有确定 50% 以上靶向效率的额外优势。这很有价值，因为基因组编辑实验中的靶向效率提高了，并且可用于检测分离的细胞群落或组织中的双等位基因编辑，而以前只能使用专门的 PCR 或扩增子测序方法来实现。
使用EXO-CIP™快速PCR清理套件处理的PCR扩增子对基因组编辑效率进行快速分析，然后是Sanger测序
对于CRISPR/CAS工作流程，核酸酶和相应GRNA的选择直接影响基因组编辑后的indel频率的计算。当前用于评估编辑效率的当前METH OD使用来自转染的细胞的合并GDNA的PCR扩增，然后是基于测序或基于测序的基于测序或基于不匹配的裂解的分析分析的变性和重新启动的indneal indneal indneal DNA（4）。为加快编辑效率的确定并避免昂贵的NG测序，“通过分解来跟踪Indels”（Tide）（5）和“ CRISPR编辑的推断”（ICE）方法（6）是开发用于使用sanger sequenc dna sequenceenc dna dna dna dna dna dna dna dna dna dna dna dna dna dna（ice）方法（ICE）方法（ICE）方法（ICE）。但是，要使这些方法可靠，分析的PCR产品必须具有高质量（例如，单个频带，没有底漆和DNTP）。在本文中，我们证明了通过Exo-CIP快速PCR清洁套件方法清理的扩增子质量匹配，该方法是通过使用ICE软件工具进行批处理分析的传统基于旋转柱的套件来实现的，从而启用了更快，更高的推出方法，以制备旋转后的样品，用于旋转后的样品。
qpcrbio探针混合Lo-rox
底漆设计：对于在快速循环条件下有效扩增，我们建议在80bp和200bp之间的扩增子长度。与所有制造商主人混合了较短的扩增子长度，反应可以循环越快。放大长度不得超过400bp。引物应使用默认引物3设置（https://bioinfo.ut.ee/primer3/）的预测熔点约为60°C。对于Taqman®探针，选择接近5'底漆的探针，避免终末鸟苷残基。对于Taqman®探针，选择接近5'底漆的探针，避免终末鸟苷残基。
长度16S rRNA测序
KINNEX 16S rRNA试剂盒将扩增的16S扩增子作为输入，并输出一个可进行测序的库，与标准的FL 16S库相比，该库将导致多达12倍的吞吐量增加。Kinnex 16S套件基于多路复用阵列测序（MAS-SEQ）方法（Al'khafaji等，2024），用于FL 16S扩增子（图3A）。结果明显更高，并且对高精度，成本效率的FL 16S测序的测序需求显着降低，每个PACBIO SMRT细胞的多重能力高达1,536个扩增子样品。我们在各种样本中测试了Kinnex 16S rRNA套件，包括模拟社区标准，凳子，唾液，植物，土壤，废水，废水和拭子（皮肤，口腔，阴道和兽医伤口）。然后，我们使用用户友好的生物信息学管道HIFI-16-Workflow分析了数据，该管道为FL 16S HIFI读取提供了快速Q-to-Report分析解决方案（图3B）。我们还检查了读取深度对样本类型中检测到的物种数量的影响（图4）。
胚胎横纹肌肉瘤中的 ERBB2（HER2）扩增：罕见病例中的潜在治疗目标？
图 1 两例 ERBB2 扩增的横纹肌肉瘤 (RMS) 的形态学、免疫组织化学 (IHC) 和遗传特征。 (A) 病例 1 中 ERBB2 扩增子范围的全基因组视图 (顶部) 和详细视图 (底部)。 (B) Circos 图描绘了 17 号染色体 (病例 1) 中的结构变异。请注意 17q 染色体臂中两个扩增子之间的交换。17q 中的两个扩增子以红色注释。 (C) IHC 显示病例 1 (左) 和病例 2 (右) 中 HER2 (ERBB2) 蛋白的细胞质表达强烈。 (D) 17 例儿童 RMS 中 ERBB2 的 mRNA 表达水平；两例 ERBB2 扩增的病例的表达值比无扩增的 RMS 高 50 倍以上。y 轴显示 log2 转换中的表达值。 （E）对病例 1 的培养细胞的间期细胞核进行荧光原位杂交 (FISH)，表明扩增的序列被组织成双微体 (dmin)
补充方法 DNA 分离 ...
补充方法 DNA 分离 使用自动 DNA 提取仪按照其协议（chemagic MSM I，PerkinElmer，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）从血液样本中分离 DNA。 使用试剂盒“EZ1&2 DNA Tissue”（Qiagen，德国希尔登）按照协议使用自动 DNA 提取仪 EZ1 Advanced XL（Qiagen）从羊膜细胞和绒毛中分离 DNA。 染色体微阵列（CMA） 使用 SureTaq DNA 标记试剂盒（Agilent，美国加利福尼亚州圣克拉拉）标记 DNA，并根据制造商的说明在 GenetiSure Cyto 4x180K CGH 微阵列（Agilent）上进行杂交。使用 InnoScan 910 AL 扫描仪（Innopsys，Carbonne，法国）扫描载玻片，并使用分析程序 Mapix（Innopsys）和 CytoGenomics 版本 5.1.2.1 和 5.3.0.14（Agilent）进行处理。使用参考基因组 GRCh38 评估数据。染色体分析和荧光原位杂交使用标准方法从肝素血样以及绒毛和羊膜细胞培养物中进行中期制备。简而言之，将来自肝素血样的细胞培养在含有植物血凝素作为有丝分裂原的 LymphoGrow 培养基（CytoGen，Sinn，德国）中，羊膜细胞培养在 Amniogrow plus 培养基（Cytogen，Sinn，德国）中，CVS 细胞培养在 Chang 培养基 D（Fujifilm，Minato，日本）中。固定后，将中期细胞滴到载玻片上，然后在 60 °C 下干燥过夜。使用核型分析系统 Ikaros（MetaSystems，德国阿尔特鲁斯海姆）通过 GTG 显带评估中期染色体的扩散情况。对于 FISH 分析，使用 Empire Genomics（美国纽约州布法罗）的探针 RP11-213E22-green 和 RP11-577D9-orange（7 号染色体）以及 RP11-358H10-green 和 RP11-241M19-orange（16 号染色体）。所有探针均按照制造商的说明使用。使用 Isis 数字成像系统（Metasystem Inc.，德国阿尔特鲁斯海姆）分析图像。 PCR 和测序 在适用的情况下，确认并进一步指定 OGM 分析中的断点，方法是使用 MinION 测序仪（Oxford Nanopore，英国牛津）进行第三代长距离测序，或使用 Hitachi 3500xL 基因分析仪（Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）进行 Sanger 测序。引物是根据 Dremsek et al., 2021 中描述的策略设计的。为了将引物定位得尽可能靠近预期的断点，OGM 数据和 CMA 数据都融入了其设计中。为了分析P1，进行了长距离PCR（连接点B/D*的扩增子：正向引物：5'-ggaggacaattttatcccccaggg-3'和反向引物：5'-gtgagccgtgagtttgccactat-3'；连接点D*/B*的扩增子：正向引物：5'-tcgttgacggtgaaatgctacgt-3'和反向引物：5'-gcagataacggagtgaggaaggc-3'）。PCR扩增后，使用引物 5' -acagctcactatagcagataggtgt- 3'、5' - ttgcatcaggaacatgtggacct- 3'、5' -ctggtcacaggcgcaaatcaaag- 3'、5' -gtcagcaaaggagagaagcagct- 3' 和 5' - gcaggttggctctttcccaagta- 3' 制备连接点 B/D* 的扩增子（大小为 4 kbp）进行 Sanger 测序。使用引物 5' -agggaaaagagatgtgtaaaatactgt- 3', 5' -agatgaggaagggcatctgac- 3', 5' -tcaagttgtcattgtggtgaatt- 3', 5' - cagatgccagcgctaagacgat- 3', 5' -aggttattacacacccctcct- 3', 5' -tgttcattatcactggccatcaga- 3', 5' -aaggggaaacctcctgctactct- 3', 5' - tgcacccactaacgtgtcatcta- 3', 5' -gggttggttccaagtctttgcta- 3', 5' -gctgaaactggatcccttcctta- 制备连接点 D*/B* 的扩增子（大小为 13 kbp），进行 Sanger 测序。 3'、5' -tgtagggacatggatgaaattgg- 3' 和 5' -ccaaacaccgcatattctcactc- 3'。为了分析 P3，进行了长距离 PCR（正向引物：5' -ttaccacgaaagagcaaacggtga- 3' 和反向引物：5' - aacgttattccttccagtcacccac- 3'）。PCR 扩增后，根据制造商的方案（SQK -LSK109，Oxford Nanopore），制备 9 kbp 大小的扩增子以在 MinION 106D 流动槽上进行测序。对于家族检测，建立了 PCR，使用倒位特异性引物 5' -tgcctctgcttaataggaagttttgg- 3' 和 5' - cagccaataacgtgagtttaggagt- 3'（产生 1247 bp 扩增子），以及野生型引物 5' - cagccaataacgtgagtttaggagt- 3' 和 5' -ctgttgaaggacacaagctctggc- 3'（产生 778 bp 扩增子）（见 S.3）。MLPA 分析进行多重连接依赖性探针扩增 (MLPA) 以验证在 CMA 中检测到的增益并测试亲属的携带者状态。对于 MLPA，将 DNA 与探针杂交并根据制造商的说明进行扩增。使用 Hitachi 3500xL 基因分析仪（Thermo Fisher）对扩增的 DNA 进行片段分析，并使用 SeqPilot（JSI，德国埃滕海姆）分析程序处理数据。用于所呈现的临床病例的 MLPA 探针组是 P034-B2、P035-B1（P1）和 P216-C1（P3）（MRC-Holland，荷兰阿姆斯特丹）。5' -tgtagggacatggatgaaattgg- 3' 和 5' -ccaaacaccgcatattctcactc- 3'。为了分析 P3，进行了长距离 PCR（正向引物：5' -ttaccacgaaagagcaaacggtga- 3' 和反向引物：5' - aacgttattccttccagtcacccac- 3'）。PCR 扩增后，根据制造商的方案（SQK -LSK109，Oxford Nanopore），制备 9 kbp 大小的扩增子以在 MinION 106D 流动池上进行测序。对于家族检测，建立了 PCR，使用倒位特异性引物 5' -tgcctctgcttaataggaagttttgg- 3' 和 5' - cagccaataacgtgagtttaggagt- 3'（产生 1247 bp 扩增子），以及野生型引物 5' - cagccaataacgtgagtttaggagt- 3' 和 5' -ctgttgaaggacacaagctctggc- 3'（产生 778 bp 扩增子）（见 S.3）。MLPA 分析进行多重连接依赖性探针扩增 (MLPA) 以验证在 CMA 中检测到的增益并测试亲属的携带者状态。对于 MLPA，将 DNA 与探针杂交并根据制造商的说明进行扩增。使用 Hitachi 3500xL 基因分析仪（Thermo Fisher）对扩增的 DNA 进行片段分析，并使用 SeqPilot（JSI，德国埃滕海姆）分析程序处理数据。用于所呈现的临床病例的 MLPA 探针组是 P034-B2、P035-B1（P1）和 P216-C1（P3）（MRC-Holland，荷兰阿姆斯特丹）。5' -tgtagggacatggatgaaattgg- 3' 和 5' -ccaaacaccgcatattctcactc- 3'。为了分析 P3，进行了长距离 PCR（正向引物：5' -ttaccacgaaagagcaaacggtga- 3' 和反向引物：5' - aacgttattccttccagtcacccac- 3'）。PCR 扩增后，根据制造商的方案（SQK -LSK109，Oxford Nanopore），制备 9 kbp 大小的扩增子以在 MinION 106D 流动池上进行测序。对于家族检测，建立了 PCR，使用倒位特异性引物 5' -tgcctctgcttaataggaagttttgg- 3' 和 5' - cagccaataacgtgagtttaggagt- 3'（产生 1247 bp 扩增子），以及野生型引物 5' - cagccaataacgtgagtttaggagt- 3' 和 5' -ctgttgaaggacacaagctctggc- 3'（产生 778 bp 扩增子）（见 S.3）。MLPA 分析进行多重连接依赖性探针扩增 (MLPA) 以验证在 CMA 中检测到的增益并测试亲属的携带者状态。对于 MLPA，将 DNA 与探针杂交并根据制造商的说明进行扩增。使用 Hitachi 3500xL 基因分析仪（Thermo Fisher）对扩增的 DNA 进行片段分析，并使用 SeqPilot（JSI，德国埃滕海姆）分析程序处理数据。用于所呈现的临床病例的 MLPA 探针组是 P034-B2、P035-B1（P1）和 P216-C1（P3）（MRC-Holland，荷兰阿姆斯特丹）。
PrimerClip™：一种修剪底漆序列的工具-Net
由于2 x 151读取长度和短扩增子设计，在读取的开头和结尾都将遇到PCR研究期间引入的合成引物序列。这些人工序列必须在变体调用之前剪辑。为实现这一目标，我们设计了对齐后软剪接底漆底座的推荐工具。Primerclip生物信息夹在5'和3'底漆碱基上，消除了从这些合成序列中调用变体的风险。除了速度外，PrimerClip还具有改进对齐末端的变体调用的优点，而对齐的末端可能会因边缘效应而受到损害。在扩增子的边缘/末端存在的变体将有更大的调用。
Authenticase M0689 手册
在许多 DIY 基因合成工作流程中，用户通过购买合成的 dsDNA（例如 gBlocks）或制备重叠寡核苷酸的扩增子来获得用于组装的片段。通常，这些部分具有直接来自用于生成片段的寡核苷酸的残留错误。Authenticase 将减少/去除扩增子中源自寡核苷酸化学合成过程中插入错误的错配/插入/缺失区域。以下方案增加了酶校正 DNA 池中正确片段的数量，随后允许 DNA 聚合酶扩增以更准确和更高效地富集扩增子。校正和富集步骤的结合提高了组装基因合成的质量，从而产生了更多具有所需正确 DNA 序列的转化细菌菌落。
新英格兰Biolabs分析证书
在许多DIY基因合成工作流中，用户通过购买合成的dsDNA（例如Gblocks）或准备重叠的寡核体的扩增子来获得用于组装的片段。通常，这些部分具有直接由用于生成碎片的寡核苷酸引起的残余误差。身份酸酶将减少/去除来自扩增子的不匹配/indel（插入/缺失）区域，这些区域源自寡核苷酸化学合成过程中掺入的误差。以下方案增加了经酶校正的DNA池中正确片段的群体，然后允许DNA聚合酶扩增以更准确性和效率富集扩增子。校正和富集步骤的组合增强了组装基因合成的质量，从而用所需的正确的DNA序列产生了较高数量的转化细菌菌落。