补充方法 DNA 分离 使用自动 DNA 提取仪按照其协议（chemagic MSM I，PerkinElmer，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）从血液样本中分离 DNA。 使用试剂盒“EZ1&2 DNA Tissue”（Qiagen，德国希尔登）按照协议使用自动 DNA 提取仪 EZ1 Advanced XL（Qiagen）从羊膜细胞和绒毛中分离 DNA。 染色体微阵列（CMA） 使用 SureTaq DNA 标记试剂盒（Agilent，美国加利福尼亚州圣克拉拉）标记 DNA，并根据制造商的说明在 GenetiSure Cyto 4x180K CGH 微阵列（Agilent）上进行杂交。使用 InnoScan 910 AL 扫描仪（Innopsys，Carbonne，法国）扫描载玻片，并使用分析程序 Mapix（Innopsys）和 CytoGenomics 版本 5.1.2.1 和 5.3.0.14（Agilent）进行处理。使用参考基因​​组 GRCh38 评估数据。染色体分析和荧光原位杂交使用标准方法从肝素血样以及绒毛和羊膜细胞培养物中进行中期制备。简而言之，将来自肝素血样的细胞培养在含有植物血凝素作为有丝分裂原的 LymphoGrow 培养基（CytoGen，Sinn，德国）中，羊膜细胞培养在 Amniogrow plus 培养基（Cytogen，Sinn，德国）中，CVS 细胞培养在 Chang 培养基 D（Fujifilm，Minato，日本）中。固定后，将中期细胞滴到载玻片上，然后在 60 °C 下干燥过夜。使用核型分析系统 Ikaros（MetaSystems，德国阿尔特鲁斯海姆）通过 GTG 显带评估中期染色体的扩散情况。对于 FISH 分析，使用 Empire Genomics（美国纽约州布法罗）的探针 RP11-213E22-green 和 RP11-577D9-orange（7 号染色体）以及 RP11-358H10-green 和 RP11-241M19-orange（16 号染色体）。所有探针均按照制造商的说明使用。使用 Isis 数字成像系统（Metasystem Inc.，德国阿尔特鲁斯海姆）分析图像。 PCR 和测序 在适用的情况下，确认并进一步指定 OGM 分析中的断点，方法是使用 MinION 测序仪（Oxford Nanopore，英国牛津）进行第三代长距离测序，或使用 Hitachi 3500xL 基因分析仪（Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）进行 Sanger 测序。引物是根据 Dremsek et al., 2021 中描述的策略设计的。为了将引物定位得尽可能靠近预期的断点，OGM 数据和 CMA 数据都融入了其设计中。为了分析P1，进行了长距离PCR（连接点B/D*的扩增子：正向引物：5'-ggaggacaattttatcccccaggg-3'和反向引物：5'-gtgagccgtgagtttgccactat-3'；连接点D*/B*的扩增子：正向引物：5'-tcgttgacggtgaaatgctacgt-3'和反向引物：5'-gcagataacggagtgaggaaggc-3'）。PCR扩增后，使用引物 5' -acagctcactatagcagataggtgt- 3'、5' - ttgcatcaggaacatgtggacct- 3'、5' -ctggtcacaggcgcaaatcaaag- 3'、5' -gtcagcaaaggagagaagcagct- 3' 和 5' - gcaggttggctctttcccaagta- 3' 制备连接点 B/D* 的扩增子（大小为 4 kbp）进行 Sanger 测序。使用引物 5' -agggaaaagagatgtgtaaaatactgt- 3', 5' -agatgaggaagggcatctgac- 3', 5' -tcaagttgtcattgtggtgaatt- 3', 5' - cagatgccagcgctaagacgat- 3', 5' -aggttattacacacccctcct- 3', 5' -tgttcattatcactggccatcaga- 3', 5' -aaggggaaacctcctgctactct- 3', 5' - tgcacccactaacgtgtcatcta- 3', 5' -gggttggttccaagtctttgcta- 3', 5' -gctgaaactggatcccttcctta- 制备连接点 D*/B* 的扩增子（大小为 13 kbp），进行 Sanger 测序。 3'、5' -tgtagggacatggatgaaattgg- 3' 和 5' -ccaaacaccgcatattctcactc- 3'。为了分析 P3，进行了长距离 PCR（正向引物：5' -ttaccacgaaagagcaaacggtga- 3' 和反向引物：5' - aacgttattccttccagtcacccac- 3'）。PCR 扩增后，根据制造商的方案（SQK -LSK109，Oxford Nanopore），制备 9 kbp 大小的扩增子以在 MinION 106D 流动槽上进行测序。对于家族检测，建立了 PCR，使用倒位特异性引物 5' -tgcctctgcttaataggaagttttgg- 3' 和 5' - cagccaataacgtgagtttaggagt- 3'（产生 1247 bp 扩增子），以及野生型引物 5' - cagccaataacgtgagtttaggagt- 3' 和 5' -ctgttgaaggacacaagctctggc- 3'（产生 778 bp 扩增子）（见 S.3）。MLPA 分析进行多重连接依赖性探针扩增 (MLPA) 以验证在 CMA 中检测到的增益并测试亲属的携带者状态。对于 MLPA，将 DNA 与探针杂交并根据制造商的说明进行扩增。使用 Hitachi 3500xL 基因分析仪（Thermo Fisher）对扩增的 DNA 进行片段分析，并使用 SeqPilot（JSI，德国埃滕海姆）分析程序处理数据。用于所呈现的临床病例的 MLPA 探针组是 P034-B2、P035-B1（P1）和 P216-C1（P3）（MRC-Holland，荷兰阿姆斯特丹）。5' -tgtagggacatggatgaaattgg- 3' 和 5' -ccaaacaccgcatattctcactc- 3'。为了分析 P3，进行了长距离 PCR（正向引物：5' -ttaccacgaaagagcaaacggtga- 3' 和反向引物：5' - aacgttattccttccagtcacccac- 3'）。PCR 扩增后，根据制造商的方案（SQK -LSK109，Oxford Nanopore），制备 9 kbp 大小的扩增子以在 MinION 106D 流动池上进行测序。对于家族检测，建立了 PCR，使用倒位特异性引物 5' -tgcctctgcttaataggaagttttgg- 3' 和 5' - cagccaataacgtgagtttaggagt- 3'（产生 1247 bp 扩增子），以及野生型引物 5' - cagccaataacgtgagtttaggagt- 3' 和 5' -ctgttgaaggacacaagctctggc- 3'（产生 778 bp 扩增子）（见 S.3）。MLPA 分析进行多重连接依赖性探针扩增 (MLPA) 以验证在 CMA 中检测到的增益并测试亲属的携带者状态。对于 MLPA，将 DNA 与探针杂交并根据制造商的说明进行扩增。使用 Hitachi 3500xL 基因分析仪（Thermo Fisher）对扩增的 DNA 进行片段分析，并使用 SeqPilot（JSI，德国埃滕海姆）分析程序处理数据。用于所呈现的临床病例的 MLPA 探针组是 P034-B2、P035-B1（P1）和 P216-C1（P3）（MRC-Holland，荷兰阿姆斯特丹）。5' -tgtagggacatggatgaaattgg- 3' 和 5' -ccaaacaccgcatattctcactc- 3'。为了分析 P3，进行了长距离 PCR（正向引物：5' -ttaccacgaaagagcaaacggtga- 3' 和反向引物：5' - aacgttattccttccagtcacccac- 3'）。PCR 扩增后，根据制造商的方案（SQK -LSK109，Oxford Nanopore），制备 9 kbp 大小的扩增子以在 MinION 106D 流动池上进行测序。对于家族检测，建立了 PCR，使用倒位特异性引物 5' -tgcctctgcttaataggaagttttgg- 3' 和 5' - cagccaataacgtgagtttaggagt- 3'（产生 1247 bp 扩增子），以及野生型引物 5' - cagccaataacgtgagtttaggagt- 3' 和 5' -ctgttgaaggacacaagctctggc- 3'（产生 778 bp 扩增子）（见 S.3）。MLPA 分析进行多重连接依赖性探针扩增 (MLPA) 以验证在 CMA 中检测到的增益并测试亲属的携带者状态。对于 MLPA，将 DNA 与探针杂交并根据制造商的说明进行扩增。使用 Hitachi 3500xL 基因分析仪（Thermo Fisher）对扩增的 DNA 进行片段分析，并使用 SeqPilot（JSI，德国埃滕海姆）分析程序处理数据。用于所呈现的临床病例的 MLPA 探针组是 P034-B2、P035-B1（P1）和 P216-C1（P3）（MRC-Holland，荷兰阿姆斯特丹）。