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World File Search System扩增子
Grantina Modern
将在预定的家庭中进行，粪便样品将在招募后六个月内随机收集两次。总基因组DNA将从样品中分离出来。底漆集将使用实时PCR进行放大，然后将在Illumina Miseq平台中测序扩增子。统计和生物信息学分析将在RSTUDIO软件和Qiime2中进行。
质粒
工程细菌基因组或克隆为细菌人造染色体（BAC）的外源DNA取决于辅助质粒的使用，这些质粒的用法将所需的工具暂时输送到细菌中以进行修饰。完成了一项挑剔的作用后，需要固化辅助质粒。为了使这种有效的质粒通过条件扩增子维持或携带反选择标记。在这里，我们描述了可以通过化学诱导或抑制来维持或治愈的新条件质粒。我们的方法基于携带Ori6Kγ起源的质粒的依赖性，其复制起源于蛋白质的存在。基于ORI6Kγ的质粒是严格调控的条件构建体，但通常需要特殊的大肠杆菌菌株才能进行操作。为了避免这种情况，我们将π蛋白表达放在共表达的条件阻遏物的控制下。通过给药或去除化学物质来调节质粒的维护与迄今为止应用的任何其他条件扩增子完全兼容。在这里，我们描述了诱导位点特定重新组合的方法为例。但是，可以使用相同的策略来为基因组编辑方法（例如λred重组酶或CRISPR/CAS成分）的任何其他瞬时成分构建合适的辅助质粒。
TDG CAS9-CKO策略
过程如下：在体外转录GRNA。cas9和grnas微注射到C57BL/6JGPT小鼠的受精卵中。受精卵被移植以获得通过PCR和靶标扩增子测序确认的阳性F0小鼠。通过与C57BL/6JGPT小鼠配对阳性F0产生小鼠获得稳定的F1生成小鼠菌株，并通过PCR和靶向Agplicon测序对所需的突变等位基因进行确认。
体内量化影响 BK 多瘤病毒 VP1 基因的 APOBEC3 突变率
摘要：BK 多瘤病毒 (BKPyV) 衣壳突变在肾移植 (KTx) 接受者体内积累，病毒持续复制。这些突变与中和逃逸有关，似乎是由于宿主细胞 APOBEC3A/B 酶使胞嘧啶脱氨而产生的。为了研究患者体内发生的致突变过程，我们扩增了 VP1 基因的分型区，对扩增子进行了 5000-10,000 × 深度测序，并确定了罕见突变，这些突变与 COSMIC 突变特征相吻合。在携带 BKPyV 基因组的质粒的扩增子中确定了背景突变，并与来自法国和越南的 23 名 KTx 接受者的 148 个样本中观察到的突变进行了比较。在尿液、血清和肾脏活检样本中持续观察到三种突变特征，其中两种，SBS2 和 SBS13，与 APOBEC3A/B 活性相对应。此外，在患者样本和体外感染 BKPyV 的细胞中均检测到了第三个病因不明的特征 SBS89。定量上，尿液样本中的 APOBEC3A/B 突变率与尿液病毒载量密切相关，并且似乎因人而异。这些结果证实，APOBEC3A/B 是患者 BKPyV 基因组突变的主要来源，但并非唯一来源。
利用 CRISPR/Cas9 改造的麦胶蛋白基因家族
摘要：小麦的 α -麦胶蛋白与其他面筋成分一起决定了面包的粘弹性。然而，它们也与人类病理有关，如乳糜泻或非乳糜泻小麦敏感性。CRISPR/Cas 已成功用于敲除面包小麦和硬粒小麦中的 α -麦胶蛋白基因，从而获得低筋小麦品系。尽管如此，这些基因的突变分析很复杂，因为它们在 A、B 和 D 亚基因组中呈现多个高度同源的拷贝串联排列。在这项工作中，我们提出了一种基于 NGS 扩增子测序的生物信息学流程，用于分析两个单向导 RNA (sgRNA) 靶向的 α -麦胶蛋白基因中的插入和缺失 (InDels)。通过与最相似的野生型亲本序列进行比较，该方法可以识别突变的扩增子并分析 InDels。对样本间比较进行了 TMM 标准化；能够研究各代中每个 InDel 的丰度，并观察 Cas9 编码序列在不同细胞系中分离的影响。该工作流程的实用性与识别可能的基因组重排（例如由于 Cas9 切割活性而导致的大量缺失）有关。该流程能够快速表征多拷贝基因家族中多个样本的突变。
使用...
摘要：现代生物学，尤其是合成生物学，在很大程度上依赖于DNA元素的结构，通常是以质粒的形式进行的。质粒用于多种应用，包括用于随后纯化的蛋白质的表达，用于生产有价值化合物的异源途径的表达以及对生物学功能和机制的研究。对于所有应用，构建质粒后的关键步骤是其序列验证。传统的序列确定方法是Sanger测序，每反应限制约为1000 bp。在这里，我们提出了一种高度可扩展的内部方法，用于使用长阅读纳米孔测序快速验证放大的DNA序列。我们开发了两步扩展和转座酶策略，为双条形码测序提供了最大的灵活性。我们还提供了一个自动分析管道，以快速可靠地分析测序结果，并为每个样本提供易于解释的结果。用户友好的duba.Flow开始到虚拟管道广泛适用。此外，我们表明，使用duba.Flow的构造验证可以通过条形码菌落PCR扩增子测序进行，从而加速了研究。关键字：合成生物学，长阅读测序，DNA构造验证，菌落PCR，实验室自动化，双条形码扩增子测序■简介
使用重组CAS9核酸酶评估基因组编辑实验中的基因座修饰
用Cas9核糖核蛋白（Cas9核酸酶）在体外消化PCR扩增子是检测indectels的敏感测定法。与不匹配检测分析不同，CAS9具有确定靶向效率超过50％的额外优势。这是有价值的，因为在基因组编辑实验中的靶向效率增加并用于检测分离的细胞菌落或组织中的双重编辑，并且以前仅使用专用PCR或Amplicon测序方法才能实现。
评估和优化从附生植物学样品中提取微生物DNA的裂解方法
分析附生植物圈中的微生物群落可能具有挑战性，尤其是在应用基于测序的技术时，由于植物来源的生物分子（例如核酸）的干扰。对附生微生物组的最新研究的综述表明，机械和酶促方法都广泛使用。在这里，我们评估了两种裂解方法对DNA提取产率，纯度，完整性和微生物16S rRNA基因拷贝数在不同提取条件下的每种模板基因组DNA的影响。此外，使用16S rRNA基因扩增子测序研究了对细菌群落组成，多样性和可重复性的影响。酶促裂解方法产生的DNA增加了一到两个数量级，但DNA质量是次优的。相反，使用Me-Chanical方法制备的样品显示出高的DNA纯度，尽管产量较低。出乎意料的是，机械裂解显示出比酶裂解更高的DNA完整性数（DIN）。16S rRNA扩增子测序结果表明，通过机械破坏制备的样品表现出可重复的相似的微生物群落组成，无论提取条件如何。相比之下，酶促裂解方法在不同的提取条件下导致分类学组成不一致。这项研究表明，机械DNA破坏比酶促破坏更适合附生层样品。
微生物学的完整NGS解决方案
病原体靶向测序（TNGS）是一种基于扩增子的测序，提供了快速且具有成本效益的解决方案，可快速筛选和鉴定常见或已知病原体。The tNGS workflow, powered by Complete Genomics' DNBSEQ-E25 sequencer with the AccuGen* Pathogen kits and software, enables the detection and quantification of 330 common pathogens (178 bacteria, 96 viruses, 56 fungi, and protozoans) and 150 drug-resistant genes from a variety of spec imens, including blood, swab, sputum, BAL, urine, CSF等。
评估内部转录序列（其）作为DNA条形码的有效性以估计真菌多样性
通用系统发育标记，例如核核糖体内部转录序列（ITS），特别是ITS1和ITS2，通常用于估计环境样品中的真菌多样性。然而，许多研究报告了ITS1和ITS2在记录真菌多样性方面的性能和功效上的差异。为了更好地理解使用ITS1与ITS2的含义，需要对多种真菌分类群的全面表示，对于对它们在多个真菌分类单元中使用的荟萃分析是必要的。为了解决这个问题，进行了详尽的文献综述，以比较和对比ITS1和ITS2作为有效的DNA条形码。公开可用的数据集用于合成代表多种真菌分类群的模拟真菌群落，并测试了两个扩增子的功效，并将其与完整的效果进行了比较。这项研究假设ITS1和ITS2对于解决真菌分类单元的分辨率同样有效。具体来说，当比较系统发育分辨率的ITS1和ITS2时，通过两种方法都确定了一组重叠的分类单元，而某些分类单元则由单个其扩增子更好地解决。此处介绍的评估应使读者可以更好地理解ITS1与ITS2在研究真菌多样性和生态学方面的用途和局限性，并使他们能够开发出改进的方法，以更好地分类分辨率，并有助于识别潜在的新物种。