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World File Search System敲入
在哺乳动物干细胞中利用通用供体进行高效、快速的荧光蛋白敲入
摘要 荧光蛋白 (FP) 标记是细胞生物学的基础方法，因为它可以观察活细胞中的蛋白质分布、动态和与其他蛋白质的相互作用。然而，使用标记蛋白过表达的典型方法可能会扰乱细胞行为并引入定位伪影。为了保持天然表达，可以将荧光蛋白直接插入内源基因中。这种方法在酵母中已经是标准做法几十年了，最近随着 CRISPR/Cas9 的出现，在无脊椎动物模型生物中也成为标准做法。然而，由于同源定向修复 (HDR) 效率低下，内源荧光蛋白标记尚未在哺乳动物细胞中广泛使用。在这里，我们描述了一种简化的方法，用于通过小鼠胚胎干细胞中的非同源末端连接 (NHEJ) 将 FP 标签高效快速地整合到天然基因座中。我们的方案最大限度地减少了使用通用供体的克隆，允许对内源蛋白进行 N 端或 C 端标记，并且从转染到成像只需不到 2 周的时间，从而提高了 FP 敲入在哺乳动物细胞中的适用性。简介荧光蛋白（FP）敲入能够实现内源性标记，从而实现蛋白质可视化，而不会产生过表达伪影1。敲入策略可以让研究人员准确观察和测量活细胞中蛋白质表达、定位和相互作用的动态。自20世纪90年代以来，FP敲入一直是酵母中的标准做法，因为这种生物可以通过同源重组有效地整合FP供体2,3。最近，由于CRISPR/Cas9技术的出现10，FP敲入已在秀丽隐杆线虫4-7和果蝇8,9中得到广泛采用。当由单向导RNA（sgRNA）编程时，Cas9会引入靶向的DNA双链断裂（DSB），细胞可以通过同源定向修复（HDR）或非同源末端连接（NHEJ）11进行修复。HDR因其高保真度而受到青睐12-15。然而，HDR 仅在某些细胞周期阶段 16 活跃，并且需要与靶标匹配的同源臂。因此，基于 HDR 的标记效率要低得多 17,18，并且需要在哺乳动物细胞中费力地克隆。为了规避这些限制，最近已引入 NHEJ 来在哺乳动物细胞中进行 FP 敲入 18–26 。一种名为 CRISPR 辅助插入标记 (CRISPaint) 22 的方法特别精简，因为它使用通用供体质粒，因此唯一需要的克隆是构建基因特异性 sgRNA。供体质粒通过转染引入细胞，与靶基因并行被 Cas9 切割，并通过 NHEJ 以非序列特异性的方式整合到靶基因中。为了允许使用任何基因特异性 sgRNA 同时保持正确的阅读框架，CRISPaint 使用通用的“框架选择器”在三种可能的阅读框架之一中切割通用供体 22 。尽管有这些优势，到目前为止，CRISPaint 仅在少数细胞系中进行了测试。此外，目前形式的 CRISPaint 系统仅可进行 C 端插入，这限制了其应用于蛋白质产物可耐受 C 端标记的基因。在这里，我们描述了一种基于 CRISPaint 的改进方法，该方法可在哺乳动物细胞中灵活、快速地在基因的任一端进行 FP 标记。我们的方法高效，需要的克隆最少，并且可以产生在天然调控元件的控制下表达的功能性内源性标记蛋白。我们在小鼠胚胎干细胞 (mESC) 中测试并优化了这种方法。我们在第一次尝试中成功标记了 5/5 个目标，从转染到成像的时间只有 2 周。此外，我们还构建了一组用于多色标记的质粒。总之，这些进展将促进 mESC 和其他哺乳动物细胞中的细胞生物学研究，并可能提供更快、更简单的快速创建敲入小鼠的途径。
CRISPR敲入协议 - 用于Jurkat细胞...
注意：确保将Cas9蛋白添加为反应中的最后材料。在KO的情况下，无需添加HDRT。表中Cas9与SGRNA的比率为1：3，对于1.8kb dsDNA，HDR为1μg。强烈建议每种特定设计对CAS9的实验优化：SGRNA比和Cas9蛋白和HDRT的量。Genscript建议通过测试1：1至1：4之间的RNP比率开始优化。我们建议最初可以将DsDNA的量设置在0.5μg和3μg之间（对于0.5kb和4KB之间的HDRT；如果HDRT长度超过此范围，则可能需要适当调整试剂的量）。为第一个实验分别设置负面对照，阳性对照和转染控制是最好的做法。
CRISPR 敲入方案
注意：确保将 Cas9 蛋白作为反应中的最后一种材料添加。在 KO 实验中，无需添加 HDRT。表中 Cas9 与 sgRNA 的比例为 1:3，对于 1.8kb ssDNA，HDRT 为 4 μ g。强烈建议针对每个具体设计对 Cas9：sgRNA 比例以及 Cas9 蛋白和 HDRT 的量进行实验优化。GenScript 建议通过测试 1:1 和 1:4 之间的 RNP 比例开始优化。我们建议 ssDNA 的量可以设置在 2 μ g 和 6 μ g 之间（对于 0.5kb 和 4kb 之间的 HDRT 长度；如果 HDRT 长度超出此范围，则可能需要适当调整试剂的量）。最好为第一次实验分别设置阴性对照、阳性对照和转染对照。
使用 dCas9-SSAP 编辑器进行长序列基因组敲入的分步方案
请参阅相关出版物和图 2 了解模板设计示例。我们建议使用在插入/替换序列（模板的编辑部分）两端至少有 200bp 同源臂的 dsDNA 模板。我们建议将模板克隆到简单的质粒中
将荧光蛋白基因定向敲入鸡体内
在鸡中，原始生殖细胞 (PGC) 是基因敲入等高级基因组编辑的有效靶点。尽管已经建立了鸡 PGC 的长期培养系统，但仍有必要选择一种高效、精确的基因编辑工具来编辑 PGC 基因组，同时保持其对生殖系统的贡献能力。与传统用于生成敲入鸡的同源重组方法相比，成簇的规律间隔短回文重复序列 (CRISPR)/CRISPR 相关蛋白 9 (Cas9) 和 CRISPR 介导的精确整合到目标染色体 (CRIS-PITCh) 方法更胜一筹，因为供体载体更易于构建、基因组编辑效率高，并且不会选择目标细胞。在本研究中，我们利用 CRIS-PITCh 方法将荧光蛋白基因盒作为融合蛋白整合到鸡 PGC 的鸡血管同源物 ( CVH ) 基因座中，从而设计了敲入鸡 PGC。敲入 PGC 在体内和体外均表达荧光蛋白，便于对 PGC 进行追踪。此外，我们还表征了设计双敲入细胞系的效率。通过有限稀释获得敲入细胞克隆，并通过基因分型确认设计双敲入细胞系的效率。我们发现 82% 的分析克隆都成功敲入了两个等位基因。我们认为，从敲入 PGC 中生产模型鸡可用于各种研究，例如阐明鸡的生殖细胞命运和性别决定。
通过 CRISPR/Cas9 介导的同源重组将人类 gdnf 敲入牛 β-酪蛋白基因座*
帕金森病 (PD) 是一种常见且使人衰弱的神经退行性疾病，其源于多巴胺能神经元的损失，并伴有进行性运动功能障碍。神经胶质细胞衍生的神经营养因子 (GDNF) 在治疗 PD 和其他神经病方面非常有前景。在本研究中，我们应用 CRISPR/Cas9 技术开发了一种基因靶向敲入系统，用于在牛 β-酪蛋白基因位点表达人类 gdnf 基因。构建了 CRISPR/Cas9 表达质粒和 pP40-GN 载体。使用组织外植体法培养和收集牛胎儿成纤维细胞。然后将 pP40-GN 和 CRISPR/Cas9 载体电转染到牛胎儿成纤维细胞中。使用 G418 筛选抗性克隆，同时通过 PCR 分析和 PCR 产物测序鉴定目标克隆。采用耳组织阻断法成功分离培养牛胎儿成纤维细胞，将pP40-GN靶载体和CRISPR/Cas9表达载体共转染牛胎儿成纤维细胞，经7天G418筛选，共获得12个健康、分离良好的细胞克隆，其中5个发生基因打靶事件。本研究为利用基因打靶牛乳腺生物反应器生产人GDNF蛋白奠定了基础，为PD的靶向治疗提供了新的策略。
基于质粒的CRISPR敲入秀丽隐杆线虫
图1。基于质粒的CRISPR敲入的高度提高的克隆效率：（a）泳道1：NEB®DNA梯子标准（N3200S）；泳道2：标准NEB®Q5PCR方案30个周期的Q5 PCR方案基于光涂抹和〜300bp的额外不需要的PCR产物导致过多的DNA，可重复出现30个周期。车道3-8：优化PDD162扩增的PCR循环编号。基于此数据，我们选择了15个周期作为PDD162所有后续扩增的最佳数字。（b）过多的PCR产物和DPNI消化不足会导致约35％的KLD连接克隆是错误的CAS9/SGRNA质粒。相反，优化PCR和KLD连接反应会导致90％的克隆具有正确的GRNA插入。（c）载体主链和用于
酪氨酸羟化酶 TH-Cre 敲入大鼠
该模型在内源性酪氨酸羟化酶 (TH) 启动子的控制下表达 cre-重组酶，从而能够在多巴胺能神经元中进行特异性表达。该模型在 TH 开放阅读框的翻译终止后立即有 (IRES)-cre 的定向插入。TH-Cre 大鼠可用于需要组织特异性表达的应用，包括光遗传学和转基因 floxed 系育种。
使用简化的 CRISPR/Cas9 敲入方法对青鳉进行内源性蛋白质标记
摘要 CRISPR/Cas9 系统已用于在多种物种中通过同源定向修复生成荧光标记的融合蛋白。尽管它取得了革命性的成功，但仍然迫切需要提高研究生物中基因组编辑的简便性和效率。在这里，我们建立了一种简化、高效且精确的 CRISPR/Cas9 介导青鳉 (Oryzias latipes) 内源性蛋白质标记策略。我们使用一种无克隆方法，该方法依赖于 PCR 扩增的供体片段，该片段包含由短同源臂 (30-40 bp) 两侧的荧光报告序列、合成的单向导 RNA 和 Cas9 mRNA。我们生成了八个新的敲入系，具有高效的 F0 靶向和种系传递效率。全基因组测序结果显示仅在目标位点发生单拷贝整合事件。我们对这些融合蛋白系进行了初步表征，大大扩展了青鳉可用的遗传工具库。具体来说，我们表明 mScarlet-pcna 线具有作为增殖区的生物范围标签和内源性细胞周期报告基因的潜力。
