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Cas12a/Cpf1 敲入小鼠可实现高效多路复用......
1. 美国康涅狄格州纽黑文耶鲁大学医学院遗传学系 2. 美国康涅狄格州西黑文耶鲁大学系统生物学研究所 3. 美国康涅狄格州西黑文耶鲁大学癌症系统生物学中心 4. 医学博士 (MD-Ph.D.)耶鲁大学免疫生物学项目，美国康涅狄格州西黑文 5. 耶鲁大学免疫生物学项目，美国康涅狄格州纽黑文 6. 耶鲁大学免疫生物学系，美国康涅狄格州纽黑文 7. 耶鲁大学分子细胞生物学、遗传学与发展项目，美国康涅狄格州纽黑文 8. 耶鲁大学耶鲁学院，美国康涅狄格州纽黑文 9. 耶鲁大学医学院神经外科系，美国康涅狄格州纽黑文 10. 耶鲁大学医学院耶鲁综合癌症中心，美国康涅狄格州纽黑文 11. 耶鲁大学医学院耶鲁干细胞中心，美国康涅狄格州纽黑文 12. 耶鲁大学医学院耶鲁生物医学数据科学中心，美国康涅狄格州纽黑文 ^ 现地址：中国湖南长沙湘雅医学院 * 共同第一作者 @ 通信：
高效的敲入方法能够实现谱系追踪...
在这里，我们设计了一种无需克隆的 39 敲入策略，用于斑马鱼，使用 PCR 扩增的 dsDNA 供体，避免破坏目标基因。dsDNA 供体携带编码荧光蛋白和 Cre 重组酶的遗传盒，与内源基因同框，但被可自裂解的肽与其隔开。具有 59 AmC6 末端保护的引物产生了具有更高整合效率的 PCR 扩增子，这些扩增子与预组装的 Cas9/gRNA 核糖核蛋白复合物共注射以进行早期整合。我们针对四个基因位点（krt92、nkx6.1、krt4 和 id2a）并生成了 10 个敲入系，它们可作为内源基因表达的报告基因。敲入 iCre 或 CreERT2 的细胞系用于谱系追踪，结果表明 nkx6.1 + 细胞是多能性胰腺祖细胞，逐渐局限于双能性导管，而 id2a + 细胞在肝脏和胰腺中都是多能性细胞，逐渐局限于导管细胞。此外，肝脏 id2a +
人类 T 细胞的大规模并行敲入工程
靶向基因敲入在细胞治疗中的应用效率普遍较低，规模有限。本研究开发了CLASH系统，该系统能够实现高效、高通量的基因敲入工程。在CLASH中，Cas12a/Cpf1 mRNA与混合腺相关病毒结合，通过大规模并行同源定向修复介导同时基因编辑和精准转基因敲入，从而产生一个稳定整合的突变变体池，每个变体都具有靶向基因编辑功能。我们将该技术应用于原代人T细胞，并使用CD3、CD8和CD4 T细胞在血癌和实体瘤模型中进行了时间进程式CLASH实验，从而实现了有利的CAR-T变体的混合生成和无偏选择。 CLASH 实验中出现了一种独特的 CRISPR RNA (crRNA)，它可以在 CAR-T 中生成 PRDM1 的外显子 3 跳跃突变，从而增强这些细胞的增殖、干细胞样特性、中枢记忆和寿命，从而在多种癌症模型（包括实体瘤模型）中提高体内疗效。CLASH 的多功能性使其广泛应用于各种细胞和治疗工程应用。
基于CRISPR的靶向转基因敲入和基因校正的策略
引言定期插入了短期短篇小学重复序列（CRISPR）已彻底改变了转基因研究和人类基因疗法的领域1 - 6。使用CRISPR，可以将与人类疾病相关的特定遗传变异引入基因组中，也可以通过设计分别由细胞和生物体的设计中的野生型等位基因代替基因组中的突变，以进行基因敲入或基因校正7-12。然后可以研究CRISPR修饰的细胞和动物模型，以发现人类疾病和药物发现的基础机制13 - 15。因此，CRISPR具有巨大的翻译潜力。CRISPR技术已被探索用于体内基因疗法，以治疗各种人类遗传疾病16-18以及过体基因疗法以治疗血液疾病，可以通过将患者的细胞在其身体外的基因改造19-23。最近几年，提高了性能和超长的巨大进步，而疾病模型和基因疗法的CRISPR介导的基因插入和替代的潜力。
