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利用 CRISPR-Cas9 多重编辑 α-淀粉酶/胰蛋白酶抑制剂基因以减少硬粒小麦中的过敏原蛋白
小麦及其衍生食品分布广泛，是全球主要食物来源之一。在过去几十年中，与小麦有关的疾病发病率已成为人类面临的全球性问题，这可能与小麦衍生食品的传播有关。已确定结构和代谢蛋白，如 α-淀粉酶/胰蛋白酶抑制剂 (ATI)，与小麦过敏（面包师哮喘）和非腹腔性小麦敏感症 (NCWS) 的发病有关。ATI 是一组外源性蛋白酶抑制剂，由分散在硬粒小麦和面包小麦的几条染色体上的多基因家族编码。WTAI-CM3 和 WTAI-CM16 亚基被认为是与面包师哮喘和可能的 NCWS 发病有关的主要蛋白质。使用 CRISPR-Cas9 多路复用策略编辑意大利硬粒小麦品种 Svevo 的谷粒中的 ATI 亚基 WTAI-CM3 和 WTAI-CM16，目的是生产出具有减少不良反应中潜在过敏原数量的小麦品系。使用无标记基因方法，即在不使用选择剂的情况下再生植物，直接从 T 0 代获得没有 CRISPR 载体的纯合突变植物。与传统育种计划相比，这项研究证明了 CRISPR 技术能够在更短的时间内敲除免疫原性蛋白质。在分子（测序和基因表达研究）或生化（免疫学测试）水平上确认了对两个目标基因的编辑。值得注意的是，作为一种多效性效应，编辑品系中的 ATI 0.28 假基因被激活。
电化学导向的有损生物功能化......
纳米技术和光子学领域的最新进展为开发新一代灵活、便携、多功能和高性能光纤传感器提供了可能性，例如基于有损模式谐振 (LMR) 的传感器。由于其灵活性和相对较高的灵敏度，这种新方法在过去 20 年中应运而生，并发现了许多应用，如折射率 (RI) [ 1 ]、电压 [ 2 ]、pH 值 [ 3 ]、湿度 [ 4 ] 和化学检测 [ 5 , 6 ]。此外，由于 RI 灵敏度高，基于 LMR 效应的无标记生物传感器的研究也已有大量报道 [ 7 , 8 ]。这种光学效应发生在光纤上的薄膜中。然而，必须满足基底（光纤）、薄覆盖层和外部介质的介电常数的特定条件。一般来说，薄膜介电常数的实部必须为正，同时其幅度要高于其虚部和分析物的介电常数 [ 7 ]。因此，要获得 LMR，需要选择合适的光纤覆盖材料。许多薄膜材料沉积在石英玻璃上时可以获得 LMR。这些材料包括半导体和金属氧化物或氮化物（氧化铟镓锌 [9]、氮化硅 [10]、氧化铟锡 (ITO) [11]、掺氟氧化锡 (FTO) [12]、氧化锡 [13]、氧化锌 [9, 14]、氧化铟 [15]、氧化钛 [16]，以及氧化铪、氧化锆和氧化钽 [17]、类金刚石碳膜 (DLC) [18] 和各种聚合物 [3]）。其中一些材料，例如 ITO [19-21] 和 FTO [12]，由于其独特的性能，例如良好的电导率和合适的带隙 [22]，已被报道能够在光学和电化学两个领域发挥作用（EC）传感器的询问是可以同时进行的。由于多个
通过无洗涤剂膜蛋白提取与表面等离子体共振生物传感器相结合筛选潜在的 P-糖蛋白抑制剂
摘要 P-糖蛋白(P-gp)在癌细胞中高表达可导致多药耐药(MDR)，抗癌药物与P-gp抑制剂联用是逆转癌症MDR治疗的一种有前途的策略。本研究建立了一种无标记、无洗涤剂的系统，结合表面等离子体共振(SPR)生物传感器和苯乙烯马来酸(SMA)聚合物膜蛋白(MPs)稳定技术来筛选潜在的P-gp抑制剂。首先，利用SMA聚合物从MCF-7/ADR细胞中提取P-gp，形成SMA脂质体(SMALPs)。随后，将SMALPs固定在SPR生物传感器芯片上，建立P-gp抑制剂筛选系统，并测定P-gp与小分子配体的亲和力。方法学考察证明该筛选系统具有良好的特异性和稳定性。从50个天然产物中筛选出9个P-gp配体，并测定了它们与P-gp的亲和常数。体外细胞验证实验表明，粉防己碱、防己诺林碱、前花素B、新黄芩素和淫羊藿苷可以显著增加MCF-7 / ADR细胞对阿霉素（Adr）的敏感性。此外，粉防己碱、前花素B和新黄芩素可以通过抑制P-gp的功能来逆转MCF-7 / ADR细胞的MDR。这是首次将基于SMALPs的稳定化策略应用于SPR分析体系。SMA聚合物可以将P-gp保留在天然脂质双层环境中，从而保持P-gp的正确构象和生理功能。所开发的系统可以快速
用于光电器件的功能性氟掺杂氧化锡涂层...
在光学和电化学等多个领域工作的传感器具有使生物传感比在单一领域工作的传感器更有效的特性。为了将这些领域结合到一个传感设备中，需要提供一组特定特性的材料。本文讨论了氟掺杂氧化锡 (FTO) 薄膜，它具有光学功能以引导损耗模式，同时具有电化学功能，即作为工作电极的导电材料。分析了基于 FTO 的光纤损耗模式谐振 (LMR) 传感器在光学和电化学领域的性能。此外，为了增强传感器的适用性，还开发了类似探针的反射配置。研究发现，FTO 可以被视为其他薄导电氧化物 (TCO) 的有前途的替代品，例如氧化铟锡 (ITO)，它迄今为止经常应用于各种双域传感概念中。在光学领域，FTO-LMR 传感器对外部折射率 (RI) 的灵敏度在 1.33 – 1.40 RIU 的 RI 范围内达到 450 nm/RIU。反过来，在电化学领域，1,1 ′-二茂铁二甲醇溶液中 FTO 电极的响应已达到 RedOx 电流低峰峰分离。与 ITO-LMR 传感器相比，FTO-LMR 传感器在很宽的电位范围内表现出施加电位对 LMR 波长偏移的显著影响。使用链霉亲和素作为目标生物材料表明，FTO-LMR 方法的无标记生物传感应用是可能的。双域功能允许在两个域中接收到的读数之间进行交叉验证，并且在应用跨域相互作用时可以增强光学灵敏度。
分裂标记介导的基因组编辑提高了 CTG 分支酵母中间假丝酵母中的同源重组频率
基因组编辑工具箱对于探索和利用非常规酵母物种作为细胞工厂至关重要，因为它们促进了基因组研究和代谢工程。非常规酵母中间假丝酵母 (Candida intermedia) 是一种在生物技术上很有趣的物种，因为它能够将多种碳源（包括林业和奶制品行业废弃物和侧流中的木糖和乳糖）转化为增值产品。然而，由于缺乏针对该物种的分子工具，迄今为止，进行基因操作的可能性有限。我们在此描述了一种针对中间假丝酵母 (C. intermedia) 的基因组编辑方法的开发，该方法基于电穿孔和基因删除盒，其中包含白色假丝酵母 NAT1 显性选择标记，两侧是与目标基因座同源的 1000 个碱基对序列。针对 ADE2 基因的线性删除盒最初导致的靶向效率 < 1%，这表明中间假丝酵母 (C. intermedia) 主要使用非同源末端连接来整合外来 DNA 片段。通过开发一种基于分裂标记的 C. intermedia 缺失技术，我们成功提高了同源重组率，实现了高达 70% 的靶向效率。对于无标记缺失，我们还将分裂标记盒与重组酶系统结合使用，从而能够通过标记回收构建双缺失突变体。总体而言，分裂标记技术被证明是一种快速可靠的 C. intermedia 基因缺失方法，这为揭示和增强其细胞工厂潜力提供了可能性。
用于光电器件的功能性氟掺杂氧化锡涂层...
在光学和电化学等多个领域工作的传感器具有使生物传感比在单一领域工作的传感器更有效的特性。为了将这些领域结合到一个传感设备中，需要提供一组特定特性的材料。本文讨论了氟掺杂氧化锡 (FTO) 薄膜，它具有光学功能以引导损耗模式，同时具有电化学功能，即作为工作电极的导电材料。分析了基于 FTO 的光纤损耗模式谐振 (LMR) 传感器在光学和电化学领域的性能。此外，为了增强传感器的适用性，还开发了类似探针的反射配置。研究发现，FTO 可以被视为其他薄导电氧化物 (TCO) 的有前途的替代品，例如氧化铟锡 (ITO)，它迄今为止经常应用于各种双域传感概念中。在光学领域，FTO-LMR 传感器对外部折射率 (RI) 的灵敏度在 1.33 – 1.40 RIU 的 RI 范围内达到 450 nm/RIU。反过来，在电化学领域，1,1 ′-二茂铁二甲醇溶液中 FTO 电极的响应已达到 RedOx 电流低峰峰分离。与 ITO-LMR 传感器相比，FTO-LMR 传感器在很宽的电位范围内表现出施加电位对 LMR 波长偏移的显著影响。使用链霉亲和素作为目标生物材料表明，FTO-LMR 方法的无标记生物传感应用是可能的。双域功能允许在两个域中接收到的读数之间进行交叉验证，并且在应用跨域相互作用时可以增强光学灵敏度。
CRISPR SWAPnDROP
生物技术、合成生物学和基础研究对多种染色体修饰的需求要求开发新技术。利用 CRISPR SWAPnDROP，我们将基因组编辑的极限扩展到细菌物种之间大规模体内 DNA 转移。其模块化平台方法有助于物种特异性适应，从而在各种物种中实现基因组编辑。在这项研究中，我们展示了 CRISPR SWAPnDROP 概念在模型生物大肠杆菌和目前增长最快、与生物技术相关的生物弧菌中的实现。我们展示了 151kb 染色体 DNA 在大肠杆菌菌株之间以及从大肠杆菌到弧菌的切除、转移和整合，而无需大小限制的中间 DNA 提取。随着大肠杆菌 MG1655 野生型乳糖操纵子的转移，我们在弧菌中建立了功能性的乳糖和半乳糖降解途径，以扩展其生物技术谱。我们还转移了大肠杆菌 DH5 α lac 操纵子，使 V. natriegens 能够进行 α 互补 - 这是朝着超快速克隆菌株迈出的一步。此外，CRISPR SWAPnDROP 旨在成为基因组工程的瑞士军刀。其应用范围包括无疤痕、无标记、迭代和并行插入和删除、基因组重排以及菌株间和物种间的基因转移。模块化特性有利于 DNA 库应用和标准化部件的回收利用。其新颖的多色无疤痕共选择系统显著提高了单次编辑的编辑效率，四次编辑的编辑效率提高到 83%，并在整个组装和编辑过程中提供视觉质量控制。
集成电阻抗生物传感器的微流体细胞培养装置中单个芽殖酵母解剖事件的实时监测
微流控装置与荧光显微镜相结合，提供了高分辨率和高内涵的平台，用于研究芽殖酵母酿酒酵母的单细胞形态、行为和复制衰老的动态过程。然而，大量记录的图像使得数据处理工作非常耗费人力和时间，而酵母复制寿命 (RLS) 是酵母衰老的主要标准。为了解决这一限制并进行无标记的 RLS 分析，引入了可通过微流控装置中的微电极轻松功能化的电阻抗谱 (EIS) 来监测芽殖酵母的细胞生长和分裂。在此，提出了一种集成 EIS 生物传感器的微流控装置，以单细胞分辨率进行酵母增殖的原位阻抗测量，从而识别子代从母代分离的瞬时事件。单个酵母细胞被可靠地固定在瓶颈状陷阱中以进行连续培养，在此过程中子细胞在水力剪切力的作用下有效地从母细胞中分离出来。每 2 分钟进行一次延时阻抗测量以监测细胞过程，包括出芽、分裂和解剖。通过使用 K 均值聚类算法首次分析自定义参数“解剖指标”，从 EIS 信号中准确提取了子细胞脱离母细胞的瞬时事件。从而验证了基于阻抗传感技术识别子细胞解剖事件。随着进一步的发展，这种集成电阻抗生物传感器的微流控装置在高通量、实时、无标记分析出芽酵母的衰老和 RLS 方面具有良好的应用前景。
Pelago-CETSA-观点-文章。......
在药物研发中，为了使药物既有效又安全，化合物与正确靶标的选择性结合非常重要。为实现这一点，药物必须出现在作用部位并以高特异性占据预期靶标。药物开发中的高流失率通常归因于概念验证研究缺乏效率或非靶标引起的毒性。1 效率低下的主要原因是预期作用部位的靶标参与不足以及对化合物作用方式的理解不完全。专利的细胞热位移分析 (CETSA) 被开发用于在生理相关环境中确定化合物与其蛋白质靶标的靶标参与。2 CETSA 是一种无标记方法，它根据加热导致的变性和聚集来评估活细胞和组织中蛋白质的热稳定性。可以对加热后上清液中剩余的可溶性蛋白质进行量化，并生成蛋白质的热熔化曲线。化合物结合通常会影响蛋白质的热稳定性，熔化曲线的变化表明细胞靶标参与（图1）。该方法适用于所有不同类型的模态，例如激动剂、拮抗剂、变构结合剂、活性位点结合剂和蛋白质 - 蛋白质相互作用干扰剂。到目前为止，CETSA 技术平台有三种主要格式。它们都共享相同的原理检测方案，但在热休克后用于蛋白质定量的方法不同（图2）。其中两种格式，CETSA Classics 和 CETSA High Throughput (HT) 都是有针对性的 CETSA 方法，用于使用抗体进行量化以确认单个已知蛋白质靶标的靶标参与。第三种格式，CETSA MS，是蛋白质组范围的细胞靶标参与测量
加速叶绿体工程
摘要：创建转基因微生物的“无标记”策略避免了潜在的抗生素抗性基因向其他微生物传播的问题。已经建立的策略，用于设计绿色Microalga衣原体的叶绿体基因组（= plastome）Reinhardtii，涉及使用在钥匙光合作用基因中携带质体突变的受体菌株恢复光合作用功能。在最小培养基上进行转化菌落的选择，使得只有在转基因DNA上进行的野生型拷贝代替突变基因的细胞才能具有光营养的生长。然而，由于使用有限的光敏性表型的突变株，这种方法可能会遭受效率问题，而在最小培养基上的生长缓慢以及未转换的细胞草坪的缓慢倒退。此外，这种光营养的救援往往依靠现有的突变体，这些突变体不一定是转化和靶向转基因插入的理想的：携带点突变的突变体可以轻易恢复，而那些没有删除的突变体不扩展到预期的转基因插入部位，这会引起缺乏过境的救援线的群体，从而引起了缺乏过境的线索。为了改善和加速C. renhardtii的转换管道，我们创建了一个新颖的受体线Hnt6，该系列在PSAA的外显子3中携带了工程删除，该删除编码了光学系统I（PSI）的核心亚基之一。我们使用荧光素酶报道器演示了HNT6的应用。这种PSI突变体是高度光敏的，可以通过在含乙酸乙酸酯的培养基上选择轻耐性，而不是在最小培养基上的光营养生长来更快地恢复转化菌落。缺失延伸到PSAA-3上游的位点，该位点是用于转基因插入的中性基因座，从而确保所有回收的菌落都是包含转基因的转化体。