生化的

CRISPR/CAS9技术在永生化的人类细胞系中的单基因编辑策略

摘要CRISPR/CAS9系统的使用在过去几年中迅速增长。在这里，描述了在人类非机智的体细胞系（NTHY-ORI）中的单核苷酸多态性的优化，突出了以克服有关递送和脱靶的问题的策略。，我们同时使用慢病毒和化学脂质作为递送剂以及两种创建双链断裂（DSB）的策略。前者通过经典的Cas9核酸酶（标准策略）诱导了DSB，而第二个则采用了修改后的CAS9产生单链破裂（SSB）。使用单链供体寡核苷酸或HR410-PA供体矢量（HR）进行敲门。可以通过将双镍酶系统与HR载体化学转染相结合来获得所需的细胞。此结果可能是由于DSB的类型造成的，这可能主要是由于Blunt（标准策略）和伸出时HR（Double Nickase）时的非同源末端连接而进行的。我们的结果表明，双镍酶适合在永生的NTHY-ORI细胞系中敲门，而标准CRISPR/ CAS9系统适合在/ DEL突变中创建基因敲除基因敲除。