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腺嘌呤碱基编辑有效恢复范康尼贫血造血干细胞和祖细胞的功能
范可尼贫血 (FA) 是一种使人衰弱的遗传性疾病，具有多种严重症状，包括骨髓衰竭和癌症易感性。CRISPR-Cas 基因组编辑通过利用 DNA 修复来操纵基因型，并已被提议作为 FA 的潜在治疗方法。但 FA 是由 DNA 修复本身的缺陷引起的，从而阻止使用同源定向修复等编辑策略。最近开发的碱基编辑 (BE) 系统不依赖于双链 DNA 断裂，可能用于靶向 FA 基因中的突变，但这仍有待测试。在这里，我们开发了一种概念验证治疗性碱基编辑策略，以解决患者造血干细胞和祖细胞中最常见的两种 FANCA 突变。我们发现，优化腺嘌呤碱基编辑器构建体、载体类型、向导 RNA 格式和递送条件可在多种 FA 患者背景中产生非常有效的基因修饰。优化的碱基编辑恢复了 FANCA 表达、FA 通路的分子功能以及对交联剂的表型抗性。ABE8e 介导的编辑在 FA 患者的原代造血干细胞和祖细胞中既具有基因型有效性，又恢复了 FA 通路功能，表明碱基编辑策略在未来 FA 临床应用中具有潜力。
全基因组碱基编辑器筛选鉴定酵母中蛋白质丰度的调节剂
摘要 蛋白质是细胞中的关键分子，其丰度不仅在基因表达水平而且在转录后水平受到广泛调控。在这里，我们描述了一种酵母基因筛选方法，该方法能够系统地表征蛋白质丰度调控在基因组中的编码方式。该筛选方法结合了 CRISPR/Cas9 碱基编辑器来引入点突变，并对内源性蛋白质进行荧光标记以方便流式细胞仪读数。我们首先使用单个 gRNA 以及正向和负向选择筛选对酵母中的碱基编辑器性能进行了基准测试。然后，我们研究了 16,452 种基因扰动对代表各种细胞功能的 11 种蛋白质丰度的影响。我们发现了数百种调控关系，包括 GAPDH 同工酶 Tdh1/2/3 与 Ras/PKA 通路之间的新联系。许多已识别的调节因子特定于这 11 种蛋白质中的一种，但我们还发现了一些基因，这些基因在受到扰动时会影响大多数测试蛋白质的丰度。虽然更具体的调控因子通常作用于转录，但广泛的调控因子往往在蛋白质翻译中发挥作用。总的来说，我们的新筛选方法为蛋白质调控网络的组成部分、规模和连通性提供了前所未有的见解。
体内腺嘌呤碱基编辑恢复了C282Y并改善了血色素沉重小鼠的铁代谢
血色素沉着症是白人种群中最常见的遗传代谢疾病之一，主要起源于HFE基因中的纯合C282Y突变。g>在基因的845位置的转变会导致HFE蛋白的折叠折叠，最终导致其在细胞膜上不存在。因此，与转素受体1和2缺乏相互作用导致系统性铁超载。我们在高度精确的细胞培养分析中筛选了潜在的GRNA，并应用了表达腺嘌呤基础编辑器ABE7.10的AAV8拆分矢量，并在129- HFE TM.1.1.1NCA小鼠中筛选了我们的候选GRNA。在这里，我们表明我们的治疗载体单次注射导致基因校正率> 10％，并且肝脏中铁代谢的改善。我们的研究提出了针对影响人类最常见的遗传疾病之一的靶向基因矫正疗法的概念验证。
用脱氨酶替换 SpCas9 HNH 结构域可生成具有替代靶向范围的紧凑型碱基编辑器
碱基编辑器是 RNA 引导的脱氨酶，可实现位点特异性核苷酸转换。这些 Cas 脱氨酶融合蛋白的靶向范围主要取决于靶基因座处原间隔区相邻基序 (PAM) 的可用性，并且仅限于 CRISPR-Cas R 环内的窗口，其中单链 DNA (ssDNA) 可供脱氨酶接触。在这里，我们推断 Cas9-HNH 核酸酶结构域在空间上限制了 ssDNA 的可及性，并证明省略该结构域会扩大编辑窗口。通过将 HNH 核酸酶结构域与单体或异二聚体腺苷脱氨酶交换，我们还设计了具有 PAM 近端移位编辑窗口的腺嘌呤碱基编辑器变体 (HNHx-ABE)。这项工作扩展了碱基编辑器的靶向范围，并提供了明显更小的碱基编辑器变体。此外，它还提供了 Cas9 蛋白质工程的未来潜在方向，其中 HNH 结构域可以被作用于 ssDNA 的其他酶取代。
使用金黄色葡萄球菌 Cas9 在马铃薯中进行 CRISPR 诱导插入/缺失和碱基编辑
。CC-BY 4.0 国际许可，根据 提供（未经同行评审认证）是作者/资助者，他已授予 bioRxiv 永久展示预印本的许可。它是此预印本的版权持有者，此版本于 2020 年 6 月 26 日发布。；https://doi.org/10.1101/2020.06.26.173138 doi：bioRxiv 预印本
人类卫星 3 DNA 编码兆碱基规模的转录因子结合平台
真核生物基因组中经常散布着大量串联重复序列，称为卫星 DNA，这些序列是组成性异染色质的基础，常位于着丝粒区域周围。虽然某些卫星 DNA 类型在着丝粒生物学中具有明确的作用，但其他丰富的卫星 DNA 的功能尚不明确。例如，人类卫星 3 (HSat3) 约占人类基因组的 2%，形成高达数十兆碱基的巨大阵列，但这些阵列在着丝粒功能中没有已知的作用，直到最近才几乎完全被排除在基因组组装之外。因此，这些巨大的基因组区域仍然相对研究不足，而 HSat3 的潜在功能作用在很大程度上仍然未知。为了解决这个问题，我们对新的 HSat3 结合因子进行了系统筛选。我们的工作表明，HSat3 阵列含有高密度的转录因子 (TF) 基序，这些基序与与多个高度保守的信号通路相关的因子结合。出乎意料的是，HSat3 中最富集的 TF 属于 Hippo 通路转录效应子家族 TEAD。我们发现 TEAD 以细胞状态特异性的方式将辅激活因子 YAP 募集到 HSat3 区域。利用 RNA 聚合酶-I 报告基因检测、HSat3 的靶向抑制、YAP 的诱导降解和超分辨率显微镜，我们表明 HSat3 阵列可以将 YAP/TEAD 定位在核仁内，YAP 在那里调节 RNA 聚合酶-I 活性。除了揭示 Hippo 通路与核糖体 DNA 调控之间的直接关系外，这项研究还表明卫星 DNA 可以编码多个转录因子结合基序，为这些巨大的基因组元素定义了新的作用。
通过 CRISPR-Cas9 碱基编辑消除 CaMKIIδ 氧化……
CRISPR-Cas9 基因编辑正在成为一种有前途的基因组突变疗法。然而，目前的编辑方法主要针对的是具有特定突变的相对较小的患者群体。在这里，我们描述了一种可能适用于广泛心脏病患者的心脏保护策略。我们使用碱基编辑来消融 CaMKII δ 的氧化活化位点，这是心脏病的主要驱动因素。我们在源自人类诱导多能干细胞的心肌细胞中表明，编辑 CaMKII δ 基因以消除氧化敏感的蛋氨酸残基可保护心肌免受缺血/再灌注 (IR) 损伤。此外，在小鼠 IR 时进行 CaMKII δ 编辑可使心脏从严重损伤中恢复功能。因此，CaMKII δ 基因编辑可能代表一种永久且先进的心脏病治疗策略。
利用高精度纳米孔 RNA 碱基调用模型增强 RNA 修饰检测和可映射性
。CC-BY-NC-ND 4.0 国际许可证（未经同行评审认证）是作者/资助者，他已授予 bioRxiv 永久展示预印本的许可。
5mC 选择性脱氨酶的发现及其在碱基分辨率甲基化位点超灵敏直接测序中的应用
摘要 挖掘噬菌体中的新酶活性对于开发新的生物技术工具仍然很重要。在本研究中，我们使用 MetaGPA（一种将宏基因组数据中的基因型与表型联系起来的方法）来识别脱氧胞苷脱氨酶，这是一种与宏病毒组中的胞嘧啶修饰高度相关的蛋白质家族。出乎意料的是，这些脱氨酶的一个子集在单核苷酸和单链 DNA 底物中都表现出对 5-甲基胞嘧啶 (5mC) 的偏好，而不是胞嘧啶 (C)。在甲基化组测序工作流程中，这些酶优先脱氨 5mC，这使得甲基化胞嘧啶能够直接转化，同时完全消除任何未修饰胞嘧啶的背景脱氨。这种直接转换允许以单碱基分辨率精确识别甲基化位点，具有无与伦比的灵敏度，为基因组和甲基化组的同时测序提供了广泛的应用。
通过腺嘌呤碱基编辑高效生成具有明确 FecBB 突变的绵羊
摘要 碱基编辑有可能改善农业中的重要经济性状，并且可以精确地将 DNA 或 RNA 序列中的单个核苷酸转换为最小的双链 DNA 断裂 (DSB)。腺嘌呤碱基编辑器 (ABE) 是最近出现的用于将目标 A:T 转换为 G:C 的碱基编辑工具，但尚未在绵羊身上使用。ABEmax 是 ABE 的最新版本之一，它由催化受损的核酸酶和实验室进化的 DNA 腺苷脱氨酶组成。骨形态发生蛋白受体 1B (BMPR1B) 基因中的 Booroola 繁殖力 (FecB B) 突变 (g.A746G, p.Q249R) 会影响许多绵羊品种的繁殖力。在本研究中，通过使用 ABEmax，我们成功获得了具有确定点突变的羔羊，这些突变导致氨基酸替换 (p.Gln249Arg)。在新生羔羊中，定义的点突变效率为 75%，因为六只羔羊在 FecB B 突变位点 (g.A746G, p.Q249R) 处为杂合子，两只羔羊为野生型。我们在八只经过编辑的羔羊中未检测到脱靶突变。在此，我们报告了由 ABE 生成的首只基因编辑绵羊的验证，并强调了其改善牲畜经济重要性状的潜力。