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表达胞嘧啶和腺嘌呤碱基编辑器的 mRNA 可有效介导体内和体外碱基校正
通过特异性校正治疗遗传病的概念几十年来一直是生物医学领域的焦点。理想的解决方案是提供一种精确的方法来永久修复此类突变而不会引入新的错误。早期的基因编辑尝试涉及使用锌指核酸酶、TALEN 和 CRISPR-Cas9 核酸酶在特定位点引入双链断裂，以刺激与外源供体 DNA 模板的同源重组以纠正缺陷。然而，这些技术也会以高频率引入插入/缺失。在这里，我们评估了瞬时 mRNA 治疗引入永久性单碱基编辑的潜力。碱基编辑器通过创新的改良 Cas9 系统提供了在体内纠正单点突变的潜力。胞嘧啶碱基编辑器 (CBE) 使用与胞嘧啶脱氨酶和尿嘧啶 DNA 糖基化酶抑制剂融合的 Cas9 切口酶。当引导链将胞嘧啶-鸟嘌呤碱基对导向基因组中的特定位置时，小窗口中的胞嘧啶-鸟嘌呤碱基对会高效地转化为胸腺嘧啶-腺嘌呤对，且插入/缺失最少。同样，腺嘌呤碱基编辑器 (ABE) 使用实验室进化的与 Cas9 切口酶融合的脱氧腺苷脱氨酶将腺嘌呤-胸腺嘧啶碱基对转化为胞嘧啶-鸟嘌呤对。与基于核酸酶的方法相比，使用碱基编辑器可增加靶向编辑频率，同时大大减少脱靶插入/缺失的形成。与病毒载体和质粒相比，mRNA 具有以下主要优势：1) 降低载体整合风险；2) 能够编辑难以转染的非分裂细胞，因为 mRNA 靶标是细胞质而不是细胞核；3) 可在体内重复给药，这对于病毒载体来说具有挑战性，因为衣壳存在免疫反应；4) 瞬时表达，这对于最大限度提高基因组编辑应用的特异性非常理想。在这项研究中，我们比较了 HEK293 细胞中经过序列优化、化学修饰的 CBE 和 ABE mRNA。Western blot 分析显示，与未修饰的 mRNA 相比，经过 5-甲氧基尿苷修饰、经过序列优化的 mRNA 表达更高。在培养细胞中，mRNA 的编辑频率高于质粒载体。我们展示了使用一个碱基编辑器 mRNA 同时编辑多个位点以及编辑以前无法访问的基因组位点的能力。这些结果证明了碱基编辑技术的深远潜力。最后，我们开发了一种小鼠模型，使用注射到小鼠受精卵中的 BE4max 变体 mRNA，该模型将用于在未来的研究中测试体内 ABE 校正。
利用 TadA 的下一代胞嘧啶碱基编辑器
• 脱氨酶的定向进化 • PAM 变体碱基编辑器 • 定向进化 Cas9 以创建用于 BE 的非 NGG PAM 变体 • 密码子、NLS 和接头优化 • 环状置换体和镶嵌碱基编辑器 • DNA 脱靶评估 • RNA 脱靶评估 • 旁观者编辑最小化 • 引导 RNA 工程 • 离体和体内 BE 递送 • 最小化脱靶活性的工程 BE • HSC、肝细胞和 T 细胞的离体碱基编辑 • ABE 的低温电子显微镜结构 • 小鼠体内碱基编辑 • 非人类灵长类动物体内编辑
GFP转基因恒河猴的克隆和碱基编辑...
我们报告了通过体细胞核移植 (SCNT) 和胚胎碱基编辑克隆了一只 12 岁的转基因绿色荧光蛋白 (GFP) 猴，同时对腺嘌呤碱基编辑器 (ABE) 进行了安全性评估。我们首先展示了 ABEmax 通过在 293T 细胞中对 GFP 序列进行 A 到 G 编辑来沉默 GFP 的能力。随后，使用表达 GFP 的猴子的供体细胞，我们成功生成了 207 个 ABEmax 编辑 (SCNT-ABE) 和 87 个野生型 (SCNT) 胚胎，用于胚胎移植、基因分型以及基因组和转录组分析。使用一种名为 OA-SCNT 的新方法，对 SCNT-ABE 和 SCNT 胚胎进行比较以进行脱靶分析，而无需遗传变异的干扰。在编辑的猴胚胎中，ABEmax 不会诱导明显的脱靶 DNA 突变，但会诱导广泛的脱靶 RNA 突变，其中 35% 是外显子。研究结果为ABE的临床应用提供了重要参考。
应用碱基编辑治疗β-血红蛋白病
本报告包含《1995 年私人证券诉讼改革法》所定义的前瞻性陈述。此类前瞻性陈述包括以下方面的陈述：临床前研究和研发计划的启动、时间安排、进展和结果，包括我们产品线的推进，包括 BEAM-101 和 BEAM-102 的推进；以及我们技术的治疗应用和潜力，包括我们通过碱基编辑为患者开发终身、治愈性、精准基因药物的潜力，所有这些都受已知和未知的重要风险、不确定性和其他因素的影响，这些因素可能导致我们的实际结果、业绩或成就、市场趋势或行业结果与此类前瞻性陈述所表达或暗示的结果存在重大差异。因此，本文中包含的任何非历史事实陈述都可能是前瞻性陈述，应按此类陈述进行评估。在不限制前述条款的情况下，“预期”、“预计”、“建议”、“计划”、“愿景”、“相信”、“打算”、“项目”、“预测”、“估计”、“目标”、“预测”、“潜在”、“应该”、“可以”、“会”、“可能”、“或许”、“将”及其否定词和类似词语和表达旨在识别前瞻性陈述。每项前瞻性陈述都受重大风险和不确定性的影响，这些风险和不确定性可能导致实际结果与该陈述中表达或暗示的结果存在重大差异，包括但不限于与以下方面相关的风险和不确定性：我们开发、获得监管部门批准和商业化我们候选产品的能力，这可能需要比计划更长的时间或花费更多；我们筹集额外资金的能力，但可能无法获得；我们为产品候选物获得、维持和执行专利和其他知识产权保护的能力；COVID-19 疫情的潜在影响；我们候选产品的临床前测试以及临床前研究和临床试验的初步或中期数据可能无法预测正在进行或后续临床试验的结果或成功；我们临床试验的启动和招募可能比预期的要长；我们的候选产品可能会遇到制造或供应中断或失败；与竞争产品相关的风险；以及“风险因素摘要”和“风险因素”标题下以及我们截至 2020 年 12 月 31 日的年度报告 10-K 表、截至 2021 年 3 月 31 日的季度报告 10-Q 表、截至 2021 年 6 月 30 日的季度报告 10-Q 表、截至 2021 年 9 月 30 日的季度报告以及随后向美国证券交易委员会（“SEC”）提交的任何文件中确定的其他风险和不确定性，这些文件可在美国证券交易委员会网站 www.sec.gov 上查阅。更多信息将通过我们的年度和季度报告以及我们不时向美国证券交易委员会提交的其他文件提供。这些前瞻性陈述仅代表截至本陈述之日的观点。可能导致我们的实际结果不同的因素或事件可能不时出现，我们不可能预测所有因素或事件。除非适用法律另有规定，否则我们不承担更新任何前瞻性陈述的义务，无论是由于新信息、未来发展还是其他原因。
DNA碱基的高纯度生产和精确编辑……
核糖核蛋白 (RNP) 复合物介导的碱基编辑与质粒或病毒载体介导的基因编辑相比，由于其脱靶效应减少，预计会带来极大益处，尤其是在治疗应用中。然而，在细菌系统中生产产量充足、纯度高的重组胞嘧啶碱基编辑器 (CBE) 或腺嘌呤碱基编辑器 (ABE) 具有挑战性。在这里，我们从人类细胞表达系统中获得了高度纯化的 CBE/ABE 蛋白，并表明与质粒编码的 CBE/ABE 相比，CBE/ABE RNP 表现出不同的编辑模式（即多个碱基到单个碱基的转化率更低），这主要是因为 RNP 在细胞中的寿命有限。此外，我们发现与质粒编码的 ABE 相比，ABE RNP 在 DNA 和 RNA 中的脱靶效应都大大降低。我们最终将 NG PAM 靶向 ABE RNPs 应用于视网膜变性 12 (rd12) 模型小鼠的体内基因校正。
碱基-4 的序列定向动态共价组装
DNA 中的信息被编码在以侧链形式固定在脱氧核糖磷酸聚合物骨架上的碱基序列中。腺嘌呤-胸腺嘧啶和鸟嘌呤-胞嘧啶成对碱基残基之间的双氢键和三氢键使互补 DNA 序列能够选择性地自组装，从而产生以四碱基编码的分子梯状结构。1 由于这种序列选择性自组装，DNA 已成为一种多功能的纳米结构介质，在热熔化和退火后，设计的 DNA 链混合物可以杂交以提供复杂的多维结构。2–4 然而，尽管基于 DNA 的纳米技术取得了成功，但对链间氢键和糖磷酸骨架的依赖可能会损害所得结构的机械、热和化学稳定性。5,6
通过 CRISPR-Cas9 碱基编辑消除 CaMKIIδ 氧化……
CRISPR-Cas9 基因编辑正在成为一种有前途的基因组突变疗法。然而，目前的编辑方法主要针对的是具有特定突变的相对较小的患者群体。在这里，我们描述了一种可能适用于广泛心脏病患者的心脏保护策略。我们使用碱基编辑来消融 CaMKII δ 的氧化活化位点，这是心脏病的主要驱动因素。我们在源自人类诱导多能干细胞的心肌细胞中表明，编辑 CaMKII δ 基因以消除氧化敏感的蛋氨酸残基可保护心肌免受缺血/再灌注 (IR) 损伤。此外，在小鼠 IR 时进行 CaMKII δ 编辑可使心脏从严重损伤中恢复功能。因此，CaMKII δ 基因编辑可能代表一种永久且先进的心脏病治疗策略。
碱基编辑业务：从实验室到临床的演变
AU：请确认所有标题级别均正确表示：随着 20 世纪 70 年代重组 DNA 技术的出现，使用基因疗法治疗人类遗传疾病的想法引起了世界各地科学家的兴趣和想象。多年后，主要得益于基于 CRISPR 的基因组编辑工具的开发，该领域呈爆炸式增长，学术实验室、初创生物技术公司和大型制药公司齐心协力开发改变生活的治疗方法。在本文中，我们重点介绍碱基编辑技术及其从实验室到临床的发展。碱基编辑于 2016 年首次报道，能够将 C•G 安装到 T•A 和将 A•T 安装到 G•C 点突变，同时在很大程度上避免了传统 CRISPR/Cas9 基因编辑的一些缺陷。尽管这些技术还很年轻，但它们已被学术实验室和治疗公司广泛使用。在这里，我们概述了碱基编辑的机制及其在临床试验中的应用。
人类造血干细胞的治疗性碱基编辑
利益冲突声明 作者声明存在经济利益冲突：详情可参见本文在线版。JKJ 在 Beam Therapeutics、Editas Medicine、Excelsior Genomics、Pairwise Plants、Poseida Therapeutics、Transposagen Biopharmaceuticals 和 Verve Therapeutics (f/k/a Endcadia) 拥有经济利益。麻省总医院和 Partners HealthCare 已审查并根据其利益冲突政策管理 JKJ 的利益。JKJ 是美国基因和细胞治疗学会董事会成员。JMG 和 JKJ 是描述本研究中使用的 A3A (N57Q) BE3 变体的专利申请的共同发明人。JKJ 还是描述基因编辑、碱基编辑和表观遗传编辑技术的各种专利和专利申请的共同发明人。JZ、YW 和 DEB 是与治疗性基因编辑技术相关的各种专利的共同发明人。
