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World File Search System脱靶
通过两性离子聚合物结合和肽融合最大限度地降低 CRISPR/Cas9 系统的脱靶频率
目前，CRISPR/Cas9 系统已广泛应用于各类生物和细胞的基因组编辑。1,2 遗憾的是，它还会在与靶序列相似的非靶位点引起不必要的突变。3 非靶突变是由 CRISPR/Cas9 RNPs 对 DNA 序列的非特异性识别引起的。4 已证明，除了最佳 PAM 序列 5-NGG-3 之外，Cas9 还可以切割具有 5-NAG-3 或 5-NGA-3′PAM 的位点，尽管效率较低。5 此外，20 nt 的单向导 RNA（sgRNA）可以识别与 sgRNA 存在多达 3 - 5 个碱基对错配的 DNA 序列，这表明在人类基因组中特定核酸酶的可能结合位点多达数千个。 3 此外，CRISPR/Cas9 可以诱导与 RNA 引导链相比含有一些额外碱基（“ DNA 凸起”）或一些缺失碱基（“ RNA 凸起”）的 DNA 序列进行非靶向切割。6 非靶向 DNA 切割可导致
工程精确的腺嘌呤基本编辑器，具有旁观者突变的无限速度和脱靶编辑
。cc-by-nc-nd 4.0国际许可证（未获得同行评审证书）获得的是作者/资助者，他已授予Biorxiv授予Biorxiv的许可，以永久显示预印本。这是该版本的版权所有，该版本发布于2022年8月13日。 https://doi.org/10.1101/2022.08.12.503700 doi：Biorxiv Preprint
经过精确编辑的克隆小牛基因组没有显示出脱靶事件或从头诱变增加的证据
。CC-BY-NC-ND 4.0 国际许可下可用（未经同行评审认证）是作者/资助者，他已授予 bioRxiv 永久展示预印本的许可。它是此预印本的版权持有者此版本于 2021 年 1 月 29 日发布。；https://doi.org/10.1101/2021.01.28.428703 doi：bioRxiv 预印本
具有有限脱靶效应的双 gRNA 方法可在体内纠正 C9ORF72 重复扩增
设计。我们为所有实验设置了阳性和阴性对照，并根据阳性和阴性对照的表现包括或排除数据点。我们使用 SPSS 来评估数据是否符合统计方法的假设，如果假设不满足，我们将调整为其他统计方法。生物复制是对生物学上不同的样本进行平行测量以捕获随机的生物学变异，这与技术复制不同，技术复制是对同一样本进行重复测量，代表多个独立测量。在免疫印迹、Southern 印迹和 GUIDE-seq 测定中，重复次数是指独立的细胞培养。对于体内和体外 RNA 焦点测量，重复次数是指
CROP：基于映射向导的 CRISPR/Cas9 向导选择程序
脱靶效应（即 DNA 切割在靶区域之外进行）是限制 CRISPR/Cas9 基因组编辑系统应用的一个主要问题。CRISPR 脱靶预测器 (CROP) 是一个独立程序，旨在通过预测向导 RNA 的脱靶倾向来解决此问题，从而允许用户选择最佳向导。CROP 使用的方法包括生成替换、删除和插入组合，然后将其映射到参考基因组中。基于这些映射的变体，进行评分和比对，然后报告为一个表格，该表格包含来自给定基因序列的所有向导 RNA 的脱靶倾向。该程序的 Python 脚本可从以下网址免费获取：https://github.com/vaprilyanto/crop。关键词：基因组编辑、向导 RNA、脱靶。简介
CRISPR-CAS9编辑和转录组的联合单细胞分析揭示了广泛的脱靶事件及其对基因表达的影响
具有CRISPR-CAS9的基因组工程中的长期障碍一直无法衡量Cas9编辑结果及其在单细胞分辨率下的功能效应。在这里，我们提出了Superb-Seq，这是一种利用T7原位转录和单细胞RNA测序的新技术，以共同测量靶向靶标Cas9编辑及其对基因表达的影响。我们在10,000 k562细胞上进行了高级seq，靶向了四个用七个引导RNA的染色质重塑基因。Superb-Seq在所有七个目标站点和其他36个非目标位点上确定了11,891个编辑事件。尽管选择了七个指南的高特异性，但其中有六个导致靶向脱靶编辑，频率从0.03％到18.6％的细胞范围不等。在USP9X的第一个内含子中，明显的脱靶编辑破坏了该基因的表达和超过150个下游基因。总而言之，由于罕见和常见的编辑事件的结合，CAS9非目标是普遍存在的，主要发生在靶向基因的内含子内，并且可以对基因表达产生广泛的影响。Superb-Seq使用现成的套件，标准设备，并且不需要病毒，这将使全基因组CRISPR屏幕能够在不同的细胞类型中以及与临床相关的指南的功能表征。
超越承诺：评估和减轻 CRISPR 基因编辑中的脱靶效应，以实现更安全的治疗
在过去十年中，CRISPR 因其能够治愈目前无法治疗的遗传疾病的潜力而彻底改变了药物开发。2012 年，CRISPR 从细菌中被改造用于人类细胞的基因编辑，值得注意的是，仅仅 11 年后，它就首次被批准作为治疗镰状细胞病和输血依赖性 β-地中海贫血的药物。然而，CRISPR 系统的应用与非预期的脱靶和在靶改变有关（包括小插入/缺失以及结构变异，例如易位、倒位和大缺失），这对患者来说是风险来源，也是开发安全疗法的关键问题。近年来，已经开发出多种方法来检测 CRISPR-Cas 核酸酶活性的不良影响。在这篇综述中，我们总结了用于脱靶评估的不同方法，讨论了它们的优点和局限性，并重点介绍了提高 CRISPR 系统安全性的策略。最后，我们讨论了它们在当前监管环境下 CRISPR 治疗临床前风险评估的相关性和应用。
CRISPR-CAS9编辑和转录组的联合单细胞分析揭示了广泛的脱靶事件及其对基因表达的影响
具有CRISPR-CAS9的基因组工程中的长期障碍一直无法衡量Cas9编辑结果及其在单细胞分辨率下的功能效应。在这里，我们提出了Superb-Seq，这是一种利用T7原位转录和单细胞RNA测序的新技术，以共同测量靶向靶标Cas9编辑及其对基因表达的影响。我们在10,000 k562细胞上进行了高级seq，靶向了四个用七个引导RNA的染色质重塑基因。Superb-Seq在所有七个目标站点和其他36个非目标位点上确定了11,891个编辑事件。尽管选择了七个指南的高特异性，但其中有六个导致靶向脱靶编辑，频率从0.03％到18.6％的细胞范围不等。在USP9X的第一个内含子中，明显的脱靶编辑破坏了该基因的表达和超过150个下游基因。总而言之，由于罕见和常见的编辑事件的结合，CAS9非目标是普遍存在的，主要发生在靶向基因的内含子内，并且可以对基因表达产生广泛的影响。Superb-Seq使用现成的套件，标准设备，并且不需要病毒，这将使全基因组CRISPR屏幕能够在不同的细胞类型中以及与临床相关的指南的功能表征。
大规模基因组和转录组测序分析揭示了植物中高活性腺嘌呤碱基编辑器诱导的突变景观
摘要背景：利用最近开发的 tRNA 腺苷脱氨酶 (TadA8e 和 TadA9) 改造的高活性腺嘌呤碱基编辑器 (ABE) 表现出强大的碱基编辑活性，但引发了人们对脱靶效应的担忧。结果：在本研究中，我们对 ABE8e 和 ABE9 诱导的水稻 DNA 和 RNA 突变进行了全面评估。对用四种 ABE（包括 SpCas9n-TadA8e、SpCas9n-TadA9、SpCas9n-NG-TadA8e 和 SpCas9n-NG-TadA9）转化的植物进行全基因组测序分析表明，含有 TadA9 的 ABE 导致更多数量的脱靶 A 到 G (A>G) 单核苷酸变体 (SNV)，而含有 CRISPR/SpCas9n-NG 的 ABE 导致水稻基因组中脱靶 SNV 总数更高。对携带 ABE 的 T-DNA 的分析表明，在 T-DNA 整合到植物基因组之前和/或之后可以引入靶向突变，在 ABE 整合到基因组之后会形成更多的脱靶 A>G SNV。此外，我们在 ABE 表达高的植物中检测到脱靶 A>G RNA 突变，但在 ABE 表达低的植物中未检测到。脱靶 A>G RNA 突变倾向于聚集，而脱靶 A>G DNA 突变很少聚集。结论：我们的研究结果表明 Cas 蛋白、TadA 变体、ABE 的时间表达和 ABE 的表达水平对水稻中的 ABE 特异性有影响，这为了解 ABE 的特异性提供了见解，并提出了除改造 TadA 变体之外增加 ABE 特异性的其他方法。
