噬菌体悬浮液:如果排序噬菌体的“活跃培养”,或者仅以这种形式可用,我们的噬菌体作为宿主生长培养基中无细菌裂解物的1 ml部分进行。细菌细胞和碎屑通过离心和随后的过滤在单速用乙酸纤维素注射器过滤器(0.2或0.45 µm孔径)中消除。所有噬菌体库存都经过滴度和斑块形态/斑块纯度的测试。向我们的客户交付的噬菌体悬挂是可以使用的,可以在收件人的实验室中传播,通常效率在1 x 10 8-1 x 10 11 11 pfu/ml(pfu = p laque f laque forming units)。我们实验室对一些更困难的噬菌体商定的最低允许的滴度限制为10 6 pfu/ml。我们不提供噬菌体滴度数据,因为在我们的实验室的测试间隔期间滴度可能会下降。噬菌体应在收到后立即冷却和黑暗。不要在不添加冷冻保护剂的情况下冷冻噬菌体悬浮液。当存储冷却时,大多数噬菌体将保持活跃,而几个月内没有明显的活动损失。但是,DSMZ不能保证在较长的存储期内噬菌体生存,请参阅我们的主页信息。如果添加了冷冻保护剂,例如,无菌甘油的10%(v/v),最终浓度,可以将噬菌体裂解物存储为长期目的。
将每个细胞悬浮液添加到包含0.5 mM玻璃珠的2 mL管中(CAT#19-622)。然后以3、4和5的速度在Omni珠子破裂4(CAT#25-010)中均匀地均匀,持续45秒。加工后,将裂解物转移到清洁2毫升试管中,并以10,000 x g离心1分钟,以弥补任何细胞碎屑。使用Quick-DNA™真菌/细菌微型REIPREP试剂盒(Zymo,Cat#D6005)1 µL DNA洗脱器在纳米光谱表(Thermo Fisher)上量化1 µL DNA洗脱器,以确定DNA浓度和纯度。
质粒载体整合了编码牛 MBL 蛋白 (21-249aa) 的基因,生成重组质粒,然后将其引入杆状病毒细胞。阳性杆状病毒细胞的选择基于其抵抗特定抗生素的能力。随后,在有利于牛 MBL 基因表达的条件下培养含有重组质粒的杆状病毒细胞。该蛋白质带有 N 端 10xHis 标签。表达后,采用亲和纯化从细胞裂解物中分离和纯化重组牛 MBL 蛋白。变性 SDS-PAGE 用于分离所得重组蛋白,从而可以估计其纯度超过 85%。
Alpha – VICTOR Nivo 系统现采用高性能激光 Alpha 技术,经验证可与我们专有的 AlphaScreen ® 和 AlphaLISA ® 技术配合使用。Alpha 免洗检测能够快速、简单、高灵敏度地检测细胞裂解物、细胞上清液、血清和各种其他样品类型中的生物分子,以及分析具有广泛亲和力的结合检测,解离常数范围从 fM 到 mM。基于激光的 Alpha 检测允许您在几分钟内测量 96 孔板和 384 孔板,同时保持高信噪比。它使几乎所有实验室都可以使用快速、灵敏的 Alpha 检测技术。
在此应用中,pDNA细胞裂解物在超滤步骤中首先浓缩10倍。然后,用Tris-Edta(TE)缓冲区完成了透明缓冲区的交换。这种UF/DF工艺历史上是使用堆叠的盒式盒子进行的,该盒子具有1.5 m 2的总有效过滤区域(EFA)。Seprapor®空心纤维进行小尺度(0.023 m 2)实验进行评估,然后按缩放到生产运行(0.4,0.8 m 2)。将此UF/DF过程与历史处理条件与盒式录音带进行比较,突出了UFSeprapor®空心纤维过滤器的几种处理优势,以纯化PDNA的TFF纯化。
ha,ch或cha。24小时后,收集细胞并用PBS彻底洗涤。细胞颗粒被加入RIPA裂解缓冲液(由上海Biyuntian Biotechnology提供),并将裂解物离心以提取蛋白质。蛋白质浓度由BCA蛋白测定试剂盒确定。接下来,进行蛋白质电泳,然后将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上。随后,膜在室温下使用5%BSA溶液进行1小时进行阻塞。之后,将膜与针对各种靶蛋白的特异性抗体在4°C下孵育过夜。然后用PBS洗涤膜,并在室温下用适当的抗兔或抗小鼠IgG抗体处理1小时。使用
补充图2。源自WT MDA-MB-231和ORAI1-KO MDA-MB-231的乳腺癌干细胞(BCSC)中Orai2,Orai3,stim1和stim2的表达。从WT和Orai1-KO(O1KO)MDA-MB-231细胞得出的干细胞中的全细胞裂解物进行10%SDS-PAGE,并用特异性抗ORAI2,抗ORAI2,抗Orai3,anti-Orai3,anti-stim1和anti-stim1和anti-2抗体进行蛋白质印迹。印迹。bar图代表Orai2(a),Orai3(b),STIM1(C)和Stim2(D)蛋白表达,以4个单独的实验的平均值±SEM表示。使用Mann-Whitney U检验对数据进行了统计分析。**** p <0.0001
• Lumit 免疫测定细胞系统是一种均质生物发光免疫测定,它将免疫检测与酶亚基互补相结合,可直接在细胞裂解物中测量目标分析物 • 蛋白质磷酸化检测:Lumit 免疫测定能够快速、无需清洗地检测激酶信号通路(如 RAS-MAPK/ERK)中的磷酸化,以进行抑制剂评估和分析 • 靶向蛋白质降解 (TPD):Lumit 免疫测定能够有效分析多种细胞系中 PROTAC 介导的蛋白质降解,支持靶向激酶降解 • 高通量筛选 (HTS):Lumit 免疫测定针对可扩展的 HTS 进行了优化,能够有效筛选 384 孔和 1536 孔格式的激酶途径调节剂
7。将磁铁与管接触,直到所有Sbeadex颗粒形成一个沉淀(通常取决于样品类型)。在继续步骤8之前,请确保将所有Sbeadex颗粒均匀。8。卸下上清液并丢弃。确保去除尽可能多的上清液,并注意不要脱离颗粒。9。将适当的洗脱缓冲液放大器和涡流添加60秒。或者,涡旋30秒,在60°C下孵育1-5分钟。洗脱缓冲液AMP体积应为步骤1中使用的裂解物体积(例如如果使用了200 µL裂解液,请添加100 µL洗脱缓冲液AMP)。为了获得较高的浓缩DNA,可以将洗脱缓冲液体积减小到20 µL。