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通过 CRISPR 协调玉米基因上调
基因组编辑技术显著提高了我们精确修改基因组和基因的能力，为设计内源途径和性状开辟了新的可能性。在玉米等作物中，已经证实可以实现小的插入/缺失、碱基变化和结构变异（Nuccio 等人，2021 年）。然而，虽然这些编辑通常会导致基因敲除 (KO) 或敲低，但许多农艺性状的改善需要更高的基因表达，有益的天然等位基因和转基因就是明证。因此，作物改良需要能够可预测和可调整地上调多个基因的工具，而没有使用转基因的技术限制和监管弊端。为了开发一种广泛适用的通过编辑增加基因表达的方法，我们寻找了一种玉米原生的小元素，可以将其插入内源启动子中以实现上调。我们在玉米基因组中发现了一个回文 12 bp 序列 GTAAGCGCTTAC（“植物增强子”，PE），它与农杆菌章鱼碱合酶启动子中已知的转录增强子元件（Bouchez 等人，1989）相似，并且也出现在其他作物（如大豆、水稻和大麦）的基因组中。为了在非同源末端连接 (NHEJ) 介导的 CRISPR/Cas 诱导的双链断裂修复过程中将 PE 插入玉米启动子中（图 1a），我们用金粒子轰击了来自 Cas9 表达系的未成熟玉米胚 (Lorenzo 等人，2022)，这些金粒子包裹着 (i) 针对谷氨酰胺合成酶 1-3 (Gln1-3) 核心启动子的合成单向导 RNA (sgRNA)，(ii) PE 三聚体 (3xPE) 作为双链寡脱氧核苷酸 (dsODN)，两端有两个保护性硫代磷酸酯键，没有任何目标同源序列，和 (iii) 携带除草剂抗性标记和荧光蛋白的表达盒的质粒，允许在再生过程中进行选择和视觉筛选。39% 的再生系在目标启动子中携带 dsODN 衍生的插入。除了完美的 3xPE 插入，由于 NHEJ 的不精确性，我们还恢复了连接处有小插入/缺失的等位基因、截断处只留下一个或两个 PE 单体或插入一个以上 3xPE 元件的等位基因（图 1b）。插入等位基因通常存在于 50% 或 100% 的扩增子测序读数中，
水稻中靶向、高效的序列插入和替换
CRISPR–Cas9 方法已被用于在植物中产生随机插入和缺失、大量缺失、短序列的靶向插入或替换以及精确的碱基变化 1 – 7 。然而，用于功能基因组学研究和作物性状改良所需的长序列和基因的靶向插入或替换的通用方法很少，并且很大程度上取决于选择标记的使用 8 – 11 。基于在哺乳动物细胞中开发的方法 12 ，我们利用化学修饰的供体 DNA 和 CRISPR–Cas9 将长达 2,049 个碱基对 (bp) 的序列（包括增强子和启动子）插入水稻基因组，效率为 25%。我们还报道了一种依赖于同源性定向修复、化学修饰的供体 DNA 和目标位点串联重复序列的基因替换方法，以 6.1% 的效率实现了长达 130 bp 的序列的替换。在哺乳动物细胞中，使用平端的、5'-磷酸化的双链寡脱氧核苷酸 (dsODN)，在两条 DNA 链的 5' 和 3' 端带有两个硫代磷酸酯键，可导致寡脱氧核苷酸 12 的强有力靶向整合。硫代磷酸酯键修饰旨在稳定细胞中的寡核苷酸，而 5'-磷酸化可促进非同源末端连接 (NHEJ)，这是修复双链断裂 (DSB) 的主要途径，尤其是在培养细胞中。在用于再生小植株的培养植物细胞中，例如水稻愈伤组织细胞，NHEJ 也是主要的 DSB 修复途径 10,13。因此，这种类型的修饰 dsODN 可能会提高植物细胞中靶向插入的效率。为了验证这一假设，从水稻ADH1（酒精脱氢酶1）14 的5′非翻译区（UTR）中取出一个60bp的翻译增强子（ADHE）作为供体DNA，插入水稻的主要耐盐基因座SKC1（补充表1）15。如图1a所示，体外合成的ADHE供体DNA两侧有两个带有硫代磷酸酯键和5′-磷酸化修饰的核苷酸（ADHE；见补充图1b）。为了与传统供体DNA进行比较，还合成了未修饰的单链和双链寡脱氧核苷酸（ssADHE和dsADHE），带有三核苷酸多态性以供检测（图1b和补充图1b）。设计了一个针对 5 ʹ UTR 的单向导 RNA (sgRNA) (sgRNA-1)，并将其构建到 CRISPR–Cas9 载体 pCBSG032 中（图 1c 和补充图 1a）。将三个供体 DNA 寡核苷酸按等摩尔比例混合，然后通过粒子轰击法将其与 CRISPR–Cas9 质粒 DNA (sgRNA-1) 一起引入中花 11 (ZH11) 水稻愈伤组织中。
![arXiv:2211.16981v2 [nucl-ex] 2023 年 6 月 7 日](/simg/e\eeb475db801c282709811fe8d5a31323d470c60e.webp)
arXiv:2211.16981v2 [nucl-ex] 2023 年 6 月 7 日
当核子被奇异数S = -1的超子（如Λ、Σ）取代时，原子核就转变为超核，从而可以研究超子-核子（Y-N）相互作用。众所周知，二体Y-N和三体Y-N-N相互作用，特别是在高重子密度下，对于理解致密恒星的内部结构至关重要[1,2]。杰斐逊实验室[3]对Λ-p弹性散射和J-PARC[4,5]对Σ−-p弹性散射进行了精确测量，最近获得了新结果，这可能有助于限制中子星内部高密度物质的状态方程。直到最近，几乎所有的超核测量都是利用轻粒子(如e、π+、K−)诱导的反应进行的[6–8]，其中从超核的光谱性质来分析饱和密度附近Y-N相互作用。利用重离子碰撞中的超核产生来研究Y-N相互作用和QCD物质的性质是过去几十年来人们感兴趣的主题[9–13]。然而，由于统计数据有限，测量主要集中在轻超核的寿命、结合能和产生产额[12，14，15]。热模型[16]和带有聚结后燃烧器的强子输运模型[17，18]计算预测在高能核碰撞中，特别是在高重子密度下，会大量产生轻超核。各向异性流动通常用于研究高能核碰撞中产生的物质的性质。由于其对早期碰撞动力学的真正敏感性 [19–22]，动量空间方位分布的傅里叶展开的一阶系数 v 1 ，也称为定向流，已对从 π 介子到轻核的许多粒子进行了分析 [23– 28]。集体流是由此类碰撞中产生的压力梯度驱动的。因此，测量超核集体性使我们能够研究高重子密度下 QCD 状态方程中的 Y - N 相互作用。在本文中，我们报告了在质心能量 √ s NN = 3 GeV Au+Au 碰撞中首次观测到 3 Λ H 和 4 Λ H 的定向流 v 1。数据由 2018 年在 RHIC 上使用固定靶 (FXT) 装置的 STAR 实验收集。能量为 3.85 GeV/u 的金束轰击厚度为 1% 相互作用长度的金靶，该靶位于 STAR 的时间投影室 (TPC) 入口处 [29]。TPC 是 STAR 的主要跟踪探测器，长 4.2 m，直径 4 m，位于沿束流方向的 0.5 T 螺线管磁场内。沿束流方向每个事件的碰撞顶点位置 V z 要求在目标位置的 ± 2 cm 范围内。
从无DNA的植物再生葡萄藤原生质体Simone scintilla 1*，Umberto salvagnin 1，Lisa Giacomelli 2，Tieme Zeilmaker 2，
从无DNA编辑的葡萄藤原生质体中的植物再生Simone scintilla 1*，Umberto salvagnin 1，Lisa Giacomelli 2，Tieme Zeilmaker 2，Mickael A. Mickael A. Malnoy A. Malnoy 1，Jeroen Rouppe Van der Voort 2，Claudio Moser 1。1果实作物，研究与创新中心的基因组学和生物学系，E. Mach 1，I-38010，San Michele A/Adige（TN）意大利； 2 Enza Zaden，Haling 1-E，1602 dB，Enkhuizen，荷兰。*通讯作者：Simone Scintilla博士（Simone.scintilla@unitn.it）。抽象的CRISPR-CAS技术已广泛扩展了植物育种中基因组编辑的应用领域，从而使遗传库中可能的特定和最小突变。关于标准基因组编辑技术，可以以核糖核蛋白（RNP）的形式引入CRISPR-CAS机械，从而避免将外源性DNA引入细胞中。对将无DNA递送到植物细胞中应用中的兴趣不断增加，尤其是在有价值的木本植物精英品种的情况下，CRISPR-CAS9技术将保留其基因型，同时仍导致靶向遗传修饰。通过确保CRISPR-CAS DNA-RNP作为RNP的无效递送，并且由于单个编辑的单元将不存在嵌合体，因此，使用CRISPR-CAS DNA-无需递送，非常适合新育种技术的需求。然而，通常通过低编辑效率和不成功的再生过程来阻碍木质植物中原生质体的细胞培养。深红色的L.胚胎愈伤组织。此策略符合无DNA策略要求。我们在这里描述了一种成功的无DNA方法，以获得完全编辑的葡萄植物，该方法是从V. vinifera cv获得的原生质体中再生的。在浓霉敏感性基因VVDMR6-2上编辑了转染的原生质体。再生的编辑植物表现出1bp或2bp的纯合缺失，以及1BP的纯合插入。引言基因组编辑技术允许以高度精确度修改细胞DNA。尤其是随着CRISPR-CAS9的出现（群集定期间隔短的短质重复 - CAS9）技术，基因组编辑的应用领域已被广泛扩展。该系统基于通过互补的RNA序列和CAS核酸酶介导的DNA双链破裂对DNA编辑位点的识别，这使得插入，缺失，甚至仅仅使一个核苷酸的修饰成为可能。因此，尤其是在木质植物遗传改善的情况下（例如葡萄藤或苹果）精英品种，CRISPR-CAS9技术可确保其基因型保存，同时导致靶向遗传修饰。CRISPR-CAS成分可以以核酸的形式引入细胞内（即DNA/mRNA编码整个系统），或以核糖核蛋白（RNP）复合物的形式进行编码。虽然DNA可以整合到基因组中，而mRNA受其内在不稳定性的影响，但RNP的直接细胞递送打开了有吸引力的场景，因为它有可能体现出强大的方法论，导致特定而最小的突变，而没有外源性DNA的痕迹（Woo等，2015）。从这种角度来看，与经典的转基因生物相比，对植物的应用兴趣可能会更好地接受消费者（Saleh等，2021）。到目前为止，已经提出了三种主要策略将CRISPR-CAS系统输送到植物细胞中。1）使用工程化的农杆菌，可以轻松克服植物细胞壁。然而，该策略采用外源质粒DNA，这些DNA含有农杆菌的DNA部分，在转化后，该策略在细胞DNA中积分为细胞DNA。对于木本植物，外源性DNA只能通过杂交去除，从而导致遗传背景的变化。成功地应用于包括木本植物在内的许多农作物的替代方法，包括T-DNA的分子切除（Dalla Costa等，2020），几乎完全去除外源性DNA。但是，剩余的最小残留外国DNA可能与许多国家的当前严格转基因生物法规不相容。2）粒子轰击使用装有生物材料的纳米颗粒子弹来射击植物组织，从而超过了细胞壁垒，并释放了纳米颗粒装载的生物货物以诱导基因组编辑。尽管如此，各种物理参数严重影响了这种方法的效率。，并非所有细胞都会被子弹击中，因此下游再生过程可能会引起嵌合植物。3）替代解决方案是暂时清除细胞壁，有效地将生物材料递送到单个细胞中。根据此策略，细胞壁是酶法消化的，因此提供了一个“裸”植物细胞（即原生质体）由质膜界定。在有利的条件下，可以通过PEG浸润，电穿孔或LiPofection轻松实现RNP的细胞递送。2-3天后，恢复了细胞壁，进一步的细胞划分